en Cáncer Humano
Extracto
El erizo (HH) vía de señalización es fundamental para el desarrollo embrionario normal, el patrón de tejido y diferenciación celular. la señalización de HH aberrante está implicado en múltiples cánceres humanos. la señalización de HH implica una cascada multi-proteína activadora de las proteínas de GLI que regulan transcripcionalmente HH genes diana. Hemos informado anteriormente de que la señalización de HH es esencial para la supervivencia de células de cáncer de colon humano y la inhibición de esta señal induce daño del ADN y muerte celular extensa. Aquí mostramos que el eje HH /GLI regula la telomerasa transcriptasa humana (hTERT), que determina el potencial de replicación de las células cancerosas inversa. Supresión de las funciones GLI1 /GLI2 por un mutante C-terminal truncado GLI3 represor (GLI3R), o por GANT61, un inhibidor farmacológico de GLI1 /GLI2, la reducción de expresión de la proteína hTERT en el cáncer de colon humano, cáncer de próstata y glioblastoma multiforme (GBM) líneas celulares . La expresión de un N-terminal suprimido mutante constitutivamente activa de GLI2 (GLI2ΔN) el aumento de hTERT mRNA y expresión de la proteína y el promotor de hTERT impulsados actividad de la luciferasa en células de cáncer de colon humano mientras GANT61 inhibe la expresión del ARNm de hTERT y de la actividad de luciferasa promotor hTERT conducido. inmunoprecipitación de la cromatina con anticuerpos Gli1 o GLI2 precipitó fragmentos del promotor de hTERT en células de cáncer de colon humano, que se redujo tras la exposición a GANT61. En contraste, la expresión de GLI1 o GLI2ΔN en células 293T no malignas no logró alterar los niveles de hTERT mRNA y proteína, o la actividad de luciferasa impulsado promotor de hTERT. Además, la expresión de GLI2ΔN aumentó la actividad de la enzima telomerasa, que se redujo por la administración GANT61 en el cáncer humano de colon, cáncer de próstata, y células de GBM. Estos resultados identifican hTERT como objetivo directo de la vía de señalización HH, y revelan un papel previamente desconocida del eje HH /GLI en la regulación del potencial de replicación de las células cancerosas. Estos hallazgos son de importancia en la comprensión de los mecanismos reguladores importantes que determinan las funciones de señalización /GLI HH en las células cancerosas
Visto:. Mazumdar T, R Sandhu, Qadan M, DeVecchio J, V Magloire, Agyeman A, et al. (2013) regula la señalización Hedgehog telomerasa transcriptasa inversa en células de cáncer humano. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10.1371 /journal.pone.0075253
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Marzo, 2013; Aceptado: August 13, 2013; Publicado: 25 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Mazumdar y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores le gustaría reconocer el apoyo financiero de la adjudicación del NCI RO1 CA 87952 (JAH), y de la Cleveland Clinic. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización de HH clásica se inicia cuando los ligandos solubles HH, sonic (SHH), Desert (DHH) o indio (IHH) HH se unen a su receptor transmembrana Patched (Ptch), liberando de este modo la proteína transmembrana, Smoothened (SMO) de la inhibición mediada por Ptch. posteriormente Smo activa la familia GLI de factores de transcripción que regulan HH genes diana. La familia de factores de transcripción GLI incluye GLI1, GLI2 y GLI3. En virtud de un activador de C-terminal y dominios represores N-terminales, GLI2 y GLI3 tienen activador dependiente del contexto o de la actividad represora. GLI1 carece del dominio y funciones represor predominantemente como un activador [1], [2]. GLI2 tiene un activador de C-terminal y dominios represores N-terminal [3]. GLI2 es informado de que el mediador inicial de HH eventos de señalización, que a su vez induce la expresión GLI1, lo que aumenta aún HH expresión del gen diana [4]. Cuando la vía de señalización de HH está activo, las proteínas citoplasmáticas GLI latentes trasladar al núcleo donde se unen los elementos GACCACCCA-como en los promotores de los genes diana HH [5], [6]. la señalización de HH regula eventos celulares mediante la modulación de los genes diana específicos. Durante el desarrollo embrionario normal, actividad de señalización HH es esencial, siendo regulada espacial y temporalmente resultante en el patrón de tejido normal y la diferenciación. la señalización de HH Coordinado también está involucrado en la proliferación celular y la supervivencia, mantenimiento de stemness y la determinación del destino de la célula [6]. Aberrante de señalización HH activado está implicado en múltiples cánceres humanos y regula la proliferación del cáncer celular, la supervivencia, las funciones de células madre de cáncer, transición epitelial a mesenquimal y la metástasis [6]. Nos han informado de que la señalización de HH es crítico para la supervivencia de las células de cáncer de colon humano, mientras que el bloqueo de estas señales induce un rápido daño en el ADN, que culmina en una amplia citotoxicidad [7], [8], [9], [10]. potencial de replicación ilimitado de células de cáncer se asocia estrechamente con la supervivencia de las células cancerosas, sin embargo, no se conoce el papel de la señalización de Hh en el potencial de replicación de las células cancerosas.
potencial de replicación de las células somáticas humanas está limitada por estructuras especiales heterocromatínicas conocida como telómeros en los extremos de los cromosomas lineales [11]. telómeros de mamífero están compuestas de repeticiones en tándem de secuencias TTAGGG que están sometidos a acortando con cada ciclo de replicación de ADN [12]. ADN polimerasas convencionales no son capaces de replicar completamente los extremos de moléculas de ADN lineal; por lo tanto, se espera que el ADN telomérico para acortar en cada ciclo de replicación del ADN. telómeros acortados por la crítica no protegen a los extremos cromosómicos que resulta en la detención del crecimiento irreversible y la vida celular limitada. Por lo tanto, la homeostasis del telómero es crítica para la proliferación celular y la supervivencia. La telomerasa, una ribonucleoproteína compuesta por un componente de ARN (TR) y una transcriptasa inversa subunidad catalítica (terc), repone las repeticiones de los telómeros y por lo tanto regula celular replicativa potencial [13]. En la mayoría de las células adultas, TR es constitutivamente presente pero la expresión de TERT se reprime, lo que resulta en la proliferación limitada esperanza de vida potencial y celular [14], [15]. En las células tales como las células madre y las células cancerosas en proliferación activa, la expresión de TERT es upregulated resultando en potencial de replicación ilimitado y la inmortalidad de estas células [16]. De TERT humana (hTERT) expresión y la actividad se ha evidenciado en & gt; 75% de células de cáncer colorrectal humano, pero sólo 3-15% de mucosa normal y que rodean las células no cancerosas [17]. En concierto con su importancia en la supervivencia de las células cancerosas, hTERT está estrictamente regulado con múltiples activadores y represores, de los cuales varios han sido identificados.
Aquí se demuestra por primera vez que la señalización de Hh upregulates trancriptionally hTERT. Supresión de GLI1 /GLI2 reduce los niveles de proteína hTERT en células de colon, cáncer de próstata y cerebro humanos. La sobreexpresión de GLI2ΔN aumentó los niveles de ARNm de hTERT, proteínas y hTERT promotor impulsado por la luciferasa (luc) la actividad en las células de cáncer de colon. El bloqueo de GLI1 /2 la actividad de reducción de la expresión de hTERT mRNA y la interacción directa entre las proteínas GLI1 /gli2 y el promotor de hTERT en células de cáncer de colon humano. En contraste, la expresión /GLI2ΔN GLI1 en células 293T no cancerosas no alteró los niveles de hTERT mRNA, proteína o la actividad del promotor de hTERT-luc. La derogación de la señalización de HH en células de cáncer disminuyó la actividad de la telomerasa, que se aumentó por la expresión GLI2ΔN. Estos resultados demuestran hTERT a ser un objetivo transcripcional de la vía de señalización HH e identificar un papel previamente desconocida del eje HH /GLI en la regulación del potencial de replicación de las células cancerosas. Estos resultados revelan una nueva función de la señalización de HH en el aumento de la capacidad replicativa de las células cancerosas. De interés, la señalización de HH regula hTERT de una manera dependiente del contexto en células cancerosas humanas, en contraste con las células no malignas, lo que puede tener implicaciones en la terapéutica del cáncer.
Materiales y Métodos
Cell de cultivo y reactivos
HT29, SW480, se obtuvieron células HCT116 y 293T de la American Type Culture Collection. C4-2, DU145 y PC3 células fueron amables dones del Dr. Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, Ohio). U87 células fueron una especie de regalo del Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, Ohio). Las células se verificaron rutinariamente por análisis microscópico de la morfología celular, características de crecimiento, y la respuesta a agentes citotóxicos [anexina V /yoduro de propidio (PI) tinción]. cDNA microarrays de perfiles de genes también fueron característicos y las células se verificaron dos veces al año para estar libres de micoplasma. HT29, HCT116, SW480, C4-2, DU145 y PC3 células se mantuvieron en medio RPMI suplementado con FBS 10% mientras que las células U87 y 293T se mantuvieron en 10% de DMEM suplementado con FBS. Las células se trataron con tripsina y se contaron usando un recuento de partículas Coulter Z2 y analizador de tamaño (Beckman Coulter). Para el análisis Western, anticuerpo contra HSP90α /β se adquirió de Santa Cruz Biotechnology; anticuerpos anti-anti-hTERT GLI1 y eran de Novus Productos Biológicos, y el anticuerpo anti-GLI2 fue de Señalización Celular Tecnología. Anti-c-myc anticuerpo (9E10) se obtuvo a partir del hibridoma Core, Lerner Research Institute. GANT61 se adquirió de Calbiochem. El Dr. Graham W. Neill (Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido) proporcionó amablemente el GLI1 y plásmidos GLI2ΔN en pBabe-Puro (PBP) vectores de expresión de mamífero. De larga duración hTERT-PBP plásmido fue un regalo del Dr. Robert Weinberg (Addgene plásmido#1771).
Análisis Western Blot
Un total de lisados celulares se prepararon utilizando tampón de lisis RIPA (Tecnología de Señalización Celular ). La proteína (60 mg) se resolvió en 10% o 5% en geles de SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno y posteriormente bloquearon en tampón de bloqueo [5% leche en polvo desnatada en 1X Tris Buffer Saline con 0,1% de Tween 20 (TBS-T)] durante 1 hora. Las membranas se lavaron en 1X TBS-T, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 hora, y finalmente desarrollaron usando sustrato Super Señal Pico de Pierce Biotechnology.
Aislamiento de ARN y Análisis mRNA
el ARN total se aisló usando el kit Qiagen RNeasy mini de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total fue convertido a cDNA utilizando cebadores aleatorios (kit de síntesis de ADNc iScript Select; BIO-RAD), y se utiliza para el análisis de la expresión de ARNm en tiempo real utilizando 40 ciclos de instrumentación y software de Applied Biosystems 7500 PCR en tiempo real. Los cebadores se diseñaron usando NCBI /Primer-BLAST y se utilizaron para generar los productos de PCR. Los GLI1, gli2 y GAPDH primers fueron descritos anteriormente [9]
hTERT cebador directo:. CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC 5'-3 '.
hTERT cebador inverso: 5'-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3'.
GLI3R y
El C-terminal suprimido GLI3R construcción myc-etiquetados transitorios transfecciones gratis (regalo del Dr. Ariel Ruiz i Altaba, Universidad de la Escuela de Medicina de Ginebra, Ginebra, Suiza) se ha descrito previamente (3). células HT29 fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000.
(Invitrogen) con GLI3R o el vector vacío pCS2-MT (regalado por el Dr. David Turner, en The Molecular & amp; Behavioral Neuroscience Institute, Universidad de Michigan, Ann Arbor , MI). Las células se utilizaron para experimentos de 24 horas, 48 horas, 72 horas después de la transfección o.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Análisis
Las células tratadas con GANT61 (20 M) durante 24 horas fueron reticulado en 1% de formaldehído /PBS, 10 min, 37 ° C, que se terminó en glicina, 5 min. Las células se lavaron en PBS y se prepararon extractos nucleares. Los núcleos se sometió a sonicación para generar fragmentos de cromatina (≈ 500-800 pb). La cromatina se precleared con una mezcla de proteína-Sepharose y proteína G-Sepharose que se bloqueó con albúmina de suero bovino (1 mg /ml) y ADN de esperma de salmón (1 mg /ml). 10% de la cromatina precleared se utilizó como control de entrada. Las cantidades iguales de los fragmentos de cromatina precleared se inmunoprecipitaron con anticuerpos específicos para GLI1 (Novus Biologicals, CO), GLI2 (Cell Signaling Technology (MA), IgG (Abcam, MA; control negativo), o de la histona H3 (Abcam, MA; control positivo ). los métodos se realizaron como se ha descrito previamente (3, 4). los productos inmunoprecipitados se lavaron extensivamente y se eluyeron. 30 l de los productos eluidos se trataron con ARNasa A y proteinasa K, seguido de cebadores específicos de reticulación y inversa de ADN aislada. Gene cuantificado las cantidades de hTERT y BCL-2 promotor de ADN en las fracciones inmunoprecipitadas. los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.
los cebadores utilizados para el análisis de chip son los siguientes:
promotor de hTERT hacia adelante: 5'-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 '
promotor de hTERT inversa:. ACACGGCCCACCCAGGGTTTA 5'-3'.
BCL2 promotor hacia adelante : 5'-CCGGACGCGC CCTCCC-3 '
BCL-2 promotor inversa:. GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC 5'-3'.
ensayo de luciferasa
El promotor de hTERT de larga duración (-3337 /+ 438), y eliminación de aguas arriba mutantes (-1226 /+ 438 y -233 /+ 438) construcciones de reportero de luciferasa impulsada fueron amablemente proporcionados por el Dr. Ralf Janknecht, Universidad de Oklahoma Health Sciences Center, OK [18] . células HT29 o 293T fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) con 4 mg del indicador de luciferasa y 0,4 mg pRLTK (luciferasa renilla impulsado por el promotor TK). 24 h después de la transfección, las células se analizaron usando el kit de luciferasa dual (Promega Corporation) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se detectó actividad de luciferasa usando Victor2 Multilabel contador, y normalizado a Renilla actividad de luciferasa como control para la eficiencia de transfección.
telomerasa Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo
Las células se lisaron en tampón de lisis 1X CHAPS y 0,25 ug de los lisados se utilizaron para llevar a cabo el ensayo TRAP. 1 g de cebador TS se marcó extremo con 3 l de γ
P32ATP (Perkin Elmer) usando 1 l de PNK (NEB) en una reacción de 20 l a 37 ° C durante 45 min y se purificó a través de una columna de Sephadex G-25 columna. En cada reacción, 2 pmol de extremo γ-32P marcado TS cebadores, y revertir cebadores para la amplificación PCR se mezclaron con 0,05 mM de dNTP, 20 mM Tris • Cl pH 8,3, MgCl 1,5 mM
2, KCl 63 mM, 0,05 % de Tween 20, y 1 mM EGTA. 20 ng de la RNasa A se añadió con el lisado celular en reacciones tratados con RNasa. la extensión del cebador mediada por la telomerasa se realizó a 30 ° C durante 30 min seguido de la amplificación PCR utilizando el TS y atrás primers. Los productos de los ensayos de TRAP se analizaron en PAGE no desnaturalizante 12,5%. Los archivos TIFF de las imágenes escaneadas de gel se cuantificaron por densitometría usando el software Image J y se determinó la actividad de la telomerasa mediante la fórmula mencionada en el protocolo del fabricante para el kit de detección TRAPEZE telomerasa (Chemicon International Inc., MA).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism (GraphPad Software, la Jolla, CA).
resultados
HH señalización regula al alza la expresión de hTERT en células humanas de cáncer
señalización desregulada HH es conocido por promover la proliferación celular, la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular en las células cancerosas humanas, por lo tanto, se consideró que la vía HH activado también puede jugar un papel en el potencial de replicación de las células cancerosas. La telomerasa, un regulador clave de la replicación del potencial y estrechamente vinculada con la proliferación celular y la supervivencia, por lo tanto, es un fuerte candidato para la regulación de la señalización de HH activada en las células cancerosas. Para probar esta hipótesis, la relación entre la HH /GLI señalización eje y la telomerasa expresión fue examinado en varias líneas celulares de cáncer humano. Nos abrogó el eje de señalización HH /GLI en varias líneas celulares de cáncer humano con inhibidores farmacológicos y expresión de la telomerasa medido. células de cáncer de colon humano HT29 y SW480, expuesto a GANT61 (20 mM), un inhibidor de molécula pequeña de GLI1 y GLI2 [9], por 72 hr demostrado un descenso de los niveles de estado estacionario de GLI1, GLI2 y proteínas hTERT (Fig. 1A). Del mismo modo, el bloqueo de la señalización /GLI HH en las células de cáncer de próstata C4-2, DU145 y PC3 demostraron también disminuyó GLI1, GLI2 y expresión de la proteína hTERT (Fig. 1A). La administración de GANT61 (20 M) a la línea celular U87 GBM durante un período de 72 horas resultó en la reducción GLI1, Gli2 y hTERT expresiones de proteínas (Fig. 1B). Hemos validado aún más los efectos de la vía de señalización de HH en la expresión de hTERT por modificación genética de la vía de señalización /GLI HH. Empleamos un C-terminal suprimido mutante de GLI3 (GLI3R, GLI3C'DCla1-myc etiquetados [3]), que reprime la actividad GLI1 y GLI2 [8]. Después de la transfección transitoria de GLI3R en HT29 (. Cuantificación densitométrica en la figura 2A) y HCT116 (Fig. 2B) líneas celulares de cáncer de colon, GLI1, GLI2 y los niveles de proteína hTERT se redujeron durante un período de 48 hr - 72 hr. Por el contrario, la expresión estable de cualquiera GLI1 o GLI2ΔN, un N-terminal elimina mutante de GLI2, con la función de activador constitutivo en las células HT29 durante 10 pasajes demostraron un aumento de expresión de proteínas hTERT (Fig. 2C).
:
HT29, SW480 (células de carcinoma de colon), C4-2, DU145 y PC3 (células de cáncer de próstata) se trataron durante 72 horas con DMSO (control del vehículo) o GANT61 (20 mM).
B:
U87 (células GBM) fueron tratados con GANT61 (20 mM) de 0-72 h. niveles de estado estacionario de GLI1, proteínas y GLI2 hTERT se determinaron mediante análisis de Western. HSP90α /β se utilizó como control de carga
A:.
HT29,
B: células HCT116
fueron transfectadas transitoriamente con GLI3R (etiqueta myc) durante 48 h ó 72 h, respectivamente. niveles de estado estacionario de GLI1, GLI2 y hTERT se determinaron mediante análisis de Western representado como la densitometría de las transferencias en
Un
con una mancha de hTERT representante (recuadro). Expresión de GLI3R se determinó usando el anticuerpo anti-myc.
C:
PBP vector vacío (V) o de larga duración GLI1 cDNA en PBP (GLI1) o GLI2ΔN en PBP (GLI2ΔN) se expresan de forma estable en células HT29, y las células se cultivaron durante 10 pasajes. niveles de estado estacionario de GLI1, GLI2 y hTERT se midieron por Western blot. HSP90α /β se utilizó como control de carga. * P & lt;.
0,0001
Factores de transcripción GLI interactuar con el promotor de hTERT en células humanas de cáncer
A continuación, se investigó el mecanismo por el cual las señales HH regulan la expresión de hTERT en el cáncer humano Células. La regulación transcripcional de la expresión de hTERT es un mecanismo común de hTERT regulación positiva en células de cáncer [19]. Dado que las proteínas de GLI son factores de transcripción, la hipótesis de que GLI1 y GLI2 transcriptionally regulan la expresión de hTERT en células de cáncer. la expresión del ARNm de hTERT fue elevado tanto en GLI1- y células HT29 gli2 sobreexpresan (Fig. 3A). Cuando las células HT29 fueron expuestos a GANT61 (20 mM), los niveles de hTERT mRNA se redujeron significativamente dentro de las 24 horas y permaneció suprimida a través de 72 horas (Fig. 3B). células DU145 demostrado disminución de los niveles de ARNm de hTERT Gli2 y cuando se expone a GANT61 (20 M) mientras que la expresión del transcrito GLI1 permaneció inalterada en 48 horas después de tratamiento (Fig. 3C). Tras la exposición a GANT61 (20 mM), las células U87 demostraron reducciones en GLI1, GLI2 y mRNA hTERT dentro de 24 horas (Fig. 3D). Estos resultados confirmaron la regulación transcripcional de la expresión de hTERT por vía de señalización de HH en las células cancerosas humanas
A:.
HT29 células que expresan de forma estable el vector vacío (V), GLI1 (GLI1) o GLI2ΔN (GLI2ΔN) fueron analizados para hTERT, GLI1 y la expresión de ARNm GLI2 determinada por PCR en tiempo real.
B:
exposición de las células HT29 a GANT61 (20 mM; 0-72 horas) redujo la expresión de ARNm de hTERT, determinada por PCR en tiempo real.
C:
DU145,
D: células U87
fueron expuestos a GANT61 (20 M; 48 horas o 24 horas respectivamente) y GLI1, GLI2 y hTERT mRNA se midió por PCR en tiempo real. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 determinaciones. * P & lt;.
0,05
Para diseccionar el mecanismo de regulación transcripcional de la expresión de hTERT por vía de señalización de HH, que supervisó los efectos de la señalización de HH sobre la actividad del promotor de hTERT en células HT29. El indicador de luciferasa impulsado por el promotor de hTERT de longitud completa (FL hTERT-luc prom) y PRL-TK fue transitoriamente co-transfectaron en líneas celulares estables HT29 derivada de sobre-expresión o GLI1 GLI2 o hTERT. Tanto las células que expresan Gli1 y GLI2ΔN demostraron un aumento de 4 veces en la actividad del promotor de hTERT dentro de 24 h de la transfección (Fig. 4A). Para identificar la longitud promotor mínimo requerido para los efectos HH-dependiente de la actividad del promotor de hTERT, el promotor de hTERT FL (-3337 /+ 438), y los mutantes de deleción de aguas arriba (-1226 /+ 438 y -233 /+ 438) impulsada por la luciferasa reporteros se co-transfectaron en células HT29, seguido de la exposición a cualquiera de control del vehículo o GANT61 (20 M) durante 24 horas. Los datos demuestran que la región -1226 /+ 438 es el requisito mínimo para HH dependiente de la activación del promotor de hTERT aunque, los efectos son menos de la del promotor de hTERT FL (Fig. 4B). La actividad del promotor de hTERT FL se redujo significativamente en el bloqueo de la actividad GLI con GANT61 (20 M) (Fig. 4B). A continuación, se investigó si los factores de transcripción GLI interactuaron directamente con el promotor de hTERT en células cancerosas.
in silico
análisis del promotor de hTERT reveló 7 supuestos sitios de unión para la familia de factores de transcripción GLI. Ambos anticuerpos Gli1 y GLI2 precipitaron fragmentos del promotor de hTERT en los análisis de chip (Fig. 4C). la amplificación por PCR de los fragmentos de cromatina utilizando cebadores específicos para las regiones promotoras de hTERT resultó en amplicones que contenían al menos el núcleo promotor de hTERT (-226 /+ 360) verificada por la secuenciación de los amplicones de PCR. La unión de GLI1 y GLI2 al promotor de hTERT se redujo en presencia de GANT61 (20 M) dentro de 24 horas (Fig. 4D). BCL-2, informó previamente como un objetivo de ambos GLI1 y GLI2, se utilizó como control positivo (Figura 4C y 4D.)
A:.
Derivados estables de células HT29 (descritos en Fig. 2C) fueron co-transfectadas con una luciferasa promotor de hTERT de longitud completa accionado (-3337 /+ 438) reportero y luciferasa de Renilla (pRL-TK) construye para 24 hr. Se prepararon lisados, y la actividad de luciferasa determinaron como se describe en Materiales y Métodos. hTERT promotor de la actividad de la luciferasa se normalizó contra la actividad de luciferasa de Renilla y se presentan como media ± SD, n = 3.
B:
HT29 células fueron co-transfectadas con cualquiera de la longitud total (-3337 /+ 438) o aguas arriba mutantes eliminados (-1226 /+ 438 o -233 /+ 438) de la prensa de fiesta hTERT-luc y pRL-TK, seguido por la exposición a GANT61 (20 M, 24 h) y determinación de la actividad de la luciferasa. hTERT promotor de la actividad de la luciferasa se normalizó contra la actividad de luciferasa de Renilla y se presentan como media ± SD, n = 3.
C:
HT29 se emplearon células para el análisis de chip utilizando anticuerpos específicos para GLI1, GLI2, o la histona H3 (positivo control, utilizada para la normalización).
D:
HT29 células tratadas con GANT61 (20 M, 24 horas) se evaluaron de manera similar por Chip análisis. Con posterioridad Real-Time PCR utiliza cebadores que flanqueaban las regiones promotoras de hTERT o el gen diana GLI, BCL-2 (control positivo). * P & lt;. 0,05
HH /GLI señalización no regulan la expresión de hTERT en células 293T no malignos
Además, investigó si la señalización de Hh transcripcionalmente regula hTERT en células no malignas. células 293T se transforman experimentalmente, pero carecen de la capacidad de formar fácilmente tumores en ratones nude [20] y demuestran un /GLI inducibles eje señalización Hh [21]. Estamos transfectadas transitoriamente células 293T con, ya sea GLI1 o expresión GLI2ΔN plásmidos, y se midió la expresión de hTERT por el análisis occidental. Aunque GLI1 y gli2 expresiones de proteínas fueron significativamente elevados en las células 293T transfectadas, expresión de la proteína hTERT se mantuvo inalterada a las 48 horas y las 72 horas (Fig. 5A). hTERT células HT29 que sobre-expresan se utilizaron como control positivo para el análisis de proteínas hTERT (Fig. 5A). Medimos la transcripción de hTERT tras la transfección transitoria de GLI2ΔN en células 293T. Dentro de 48 h de transfección, las células 293T demostraron aumento robusto en GLI2 mRNA y & gt; 5 veces de incremento en los niveles de ARNm de GLI1, pero no elevación significativa en el nivel de hTERT mRNA (Fig 5B.). Además, la co-transfección transitoria de la hTERT-luc reportero prom FL y, o bien plásmidos de expresión GLI2ΔN GLI1 o no aumentó la actividad de luciferasa en células 293T (Fig. 5C). Estos resultados ponen de relieve las funciones dependientes del contexto de la ruta de señalización de HH que regula al alza la expresión de hTERT de forma selectiva en las células malignas en contraste con las células no malignas
A:.
Células 293T se dejaron sin tratar (UT), transfectadas transitoriamente con el vector vacío (V) o GLI1 marcado con GFP (GLI1) o GLI2ΔN etiquetado-GFP (GLI2ΔN). Se determinó la expresión de GLI1, GLI2 y hTERT durante 48 y 72 horas por análisis de Western. HSP90α /β se utilizó como control de carga y GFP se utiliza para marcar proteínas GLI GFP-etiquetados expresados exógenamente. lisado total de células a partir de células HT29 de forma estable que expresan hTERT (HT29 + hTERT) sirvió como control positivo.
B:
células 293T transfectadas transitoriamente con vector o GLI2 (como se describe en la Figura 5A) se analizaron para GLI1, GLI2 y la expresión de hTERT mRNA mediante qPCR. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 determinaciones.
C: células 293T
transitoriamente co-transfectadas con FL-prom hTERT-luc, reporteros Renilla luceferase y el vector, o GLI1 GLI2 (como se describe en la figura 5A). Se analizaron las 24 horas después de la transfección las células para la actividad luciferasa. la actividad de luciferasa promotor impulsado hTERT se normalizó contra la actividad de luciferasa de Renilla y se representa como media ± SD, n = 3. * p & lt;. 0,05
HH /GLI regula la señalización de hTERT actividad enzimática en células humanas de cáncer
regulación al alza de la expresión aberrante de hTERT se asocia con un aumento de la actividad inversa de la telomerasa enzima transcriptasa en las células cancerosas. Por lo tanto, hemos probado la importancia funcional del eje /GLI /hTERT HH mediante la medición de la actividad enzimática de la telomerasa en las células cancerosas. Se usó un ensayo TRAP para determinar la actividad de hTERT en la alteración de la cascada de señalización de HH /GLI. GANT61 (20 M) la administración llevó a la actividad de la telomerasa reducido en 48 horas, que se mantuvo durante un máximo de 72 horas en las células HT29 (Fig. 6A, cuantificado en la Fig. S1). A la inversa, derivados estables de células HT29 que expresan GLI2ΔN demostrado una mayor actividad de la telomerasa en comparación con el control de vectores, mientras GLI1 que sobre-expresan células tenían un modesto incremento en la actividad de telomerasa (Fig. 6B, cuantificado en la Fig. S1). hTERT sobre-expresión de células con actividad de la telomerasa elevada sirvió como control positivo (Fig. 6B). Actividad de la telomerasa se redujo en las células DU145 expuestos a GANT61 (0-30 mM) durante 48 h (Fig. 6C). células U87 también demostraron reducciones en la actividad de la telomerasa dentro de 48 h de exposición a GANT61 (20 mM), que se mantuvo hasta 72 horas (Fig. 6D). Estas observaciones demuestran que la señalización de HH regula positivamente tanto la expresión de hTERT y la actividad de la telomerasa en las células cancerosas humanas
A:.
HT29 células fueron tratadas con GANT61 (20 mM) de 0-72 horas, y Los lisados se extrajeron a intervalos para el análisis TRAP. 100 pb escalera de ADN se usó como un marcador molecular (M).
B:
HT29 células que expresan de forma estable vector (V), o GLI1 GLI2 (GLI2ΔN) (descrito en la figura 3A) fueron evaluados para la actividad de telomerasa mediante un ensayo TRAP. hTERT que sobre-expresan las células se utilizaron como control positivo.
C:
U87 y
D:. DU145 células fueron tratadas con
GANT61 (0-30 mM; 0-72 hr) y la actividad de la telomerasa se analizó mediante el ensayo TRAP
Discusión
HH es esencial para el desarrollo embrionario normal donde regula la diferenciación celular y la formación de órganos de una manera dependiente de gradientes [22]. la señalización de HH regula la proliferación celular mediante la modulación de transcripcionalmente genes que controlan la progresión del ciclo celular tal como la ciclina D, ciclina E y, también por el secuestro mediada por Ptch de ciclina B en el cyctoplasm [23], [24], [25]. En la etapa adulta, la señalización de HH activa persiste en un pequeño subconjunto de células que confieren potencial de regeneración de los órganos maduros [26]. La desregulación de la señalización de HH se ha informado en varios cánceres humanos, incluyendo el carcinoma de células basales [27], [28], meduloblastoma [1], [29], rabdomiosarcoma [30], glioma [1], adenocarcinoma de páncreas [31], [ ,,,0],32], [33], cáncer de próstata [34] y carcinoma de colon [7], [8], [9], [10]. En las células cancerosas, los mecanismos independiente de ligando dependiente de ligando y de oncogenes impulsada autocrinos mantienen una cascada de señalización HH activo. HH actividad aberrante impulsa la formación de tumores y el mantenimiento del tumor mediante la inducción de señales pro-supervivencia y el bloqueo de las señales de apoptosis en células de cáncer [9], [35]. Otra característica del cáncer es potencial de proliferación ilimitada de las células cancerosas que resultan en la inmortalidad, sin embargo, un enlace a desregulado señalización de HH no se conocía.
Los telómeros son estructuras especializadas de nucleoproteína en los extremos cromosómicos que son importantes para la estabilidad cromosómica y la inmortalidad de Células. las células somáticas normales encuentran con un desgaste gradual de las longitudes de los telómeros en cada ciclo de replicación del ADN limitando de este modo la vida celular. las células madre normales y las células cancerosas escapan a esta comprobación y reponer sus longitudes telómero por el aumento de la actividad de la telomerasa. La telomerasa es una ribonucleoproteína compuesto de la telomerasa humana enzima de transcriptasa inversa, hTERT y ARN de telomerasa, hTR [36], [37]. En las células cancerosas, la expresión de hTERT se restauró de forma aberrante lo que aumenta la actividad de la telomerasa que mantiene la longitud del telómero y confiere potencial de replicación ilimitado. hTERT expresión y la actividad de la telomerasa tiene una estrecha asociación [33] con los cánceres humanos [17], [38]. La transformación de células normales telomerasa-negativos in vitro requiere la expresión de hTERT [39], delineando la expresión de hTERT como un paso limitante de la velocidad en la longitud del telómero homeostasis y la transformación celular. La regulación de la expresión de hTERT ha sido ampliamente estudiado y numerosos reguladores positivos y negativos se han identificado [40], [41].
En este estudio, hemos demostrado por primera vez que la vía de señalización de HH asegura ilimitada potencial de replicación de las células cancerosas mediante la regulación de la expresión y actividad de hTERT. En varias líneas celulares de cáncer humano como el de colon, de próstata y el cerebro, la supresión de GLI1 y expresión GLI2 usando GANT61, un inhibidor de molécula pequeña resultó en la reducción de expresión de hTERT mRNA, proteína y actividad enzimática. Este hallazgo indica un eje regulador de los HH de señalización y hTERT en células cancerosas humanas. El uso de un enfoque genético para suprimir GLI1 y GLI2 usando GLI3R, la expresión de hTERT también podría ser inhibida en células de cáncer de colon. La expresión forzada de GLI1 o un mutante constitutivamente activa de expresión GLI2 aumento de hTERT mRNA y de la proteína en células de cáncer de colon humano que demuestran la regulación mediada por GLI HH /de expresión de hTERT.