Extracto
metástasis crónica inflamación promovido ha sido considerado como un importante reto en la terapia del cáncer. citoquina pro-inflamatoria TNF puede inducir la invasión y la metástasis del cáncer asociado con la transición epitelio-mesenquimal (EMT). Sin embargo, los mecanismos subyacentes no están del todo claras. En este estudio, hemos demostrado que TNF induce la EMT en las células HCT116 humanos y por lo tanto promueve el cáncer colorrectal invasión y metástasis (CRC). TNFa inducida EMT se caracteriza por la adquisición de la morfología mesenquimal de tipo huso y el aumento de la expresión de N-cadherina y fibronectina con una disminución concomitante de la E-cadherina y Zona ocludina 1 (ZO-1). tratamiento TNFa también aumentó la expresión del factor de transcripción Snail, pero no Slug, ZEB1 y Twist. La sobreexpresión de Snail indujo un cambio de E-cadherina a la expresión N-cadherina en células HCT116, que es una característica de EMT. Por el contrario, desmontables de Snail significativamente atenuada EMT TNFa inducida en las células HCT116, lo que sugiere que Snail juega un papel crucial en la EMT TNFa inducida. Curiosamente, la exposición a TNF aumentó rápidamente la expresión de Snail de proteínas y Caracol de localización nuclear, pero no ARNm nivel de regulación al alza. Por último, hemos demostrado que TNF elevada estabilidad Caracol mediante la activación de AKT y posteriormente reprimir la actividad de GSK-3β y la disminución de la asociación de caracol con GSK-3β. Desmontables de GSK-3β verificado aún más nuestro hallazgo. En conjunto, estos resultados revelaron que se requiere AKT /estabilización mediada por GSK-3β de caracol por EMT TNFa inducida en las células de CRC. Nuestro estudio proporciona una mejor comprensión de la inflamación inducida por metástasis de CCR
Visto:. Wang H, Wang H-S, Zhou B-H, Li C-L, M Zhang, Wang X-F, et al. (2013) La transición epitelio-mesenquimal (EMT) inducida por el TNF-α Requiere AKT /GSK-3β-mediada Estabilización de Snail en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10.1371 /journal.pone.0056664
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado 14 de enero de 2013; Publicado: 19 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa, Nº 2011CB935800), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30873032 y Nº 81071712). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inflamación crónica se ha identificado a asociarse íntimamente con la tumorigénesis [1], [2]. evidencias cada vez mayores han demostrado que el microambiente tumoral inflamatoria juega un papel crucial en el desarrollo tumoral y la metástasis [3]. microambiente tumoral es orquestada en gran medida por las células inflamatorias, que facilitan la ruptura de la matriz extracelular, la angiogénesis y la remodelación de tejidos, por lo tanto promover la motilidad de las células tumorales [4]. Además, las células tumorales propiamente dichas pueden secretar citocinas proinflamatorias que contribuyen directamente a la progresión maligna [5]. Las complejas interacciones entre el tumor y las células inflamatorias mediadas por citoquinas inflamatorias son un aspecto esencial de la microambiente tumoral [6]. Factor de necrosis tumoral α (TNF), una citoquina proinflamatoria producida principalmente por los macrófagos, es una molécula clave en la regulación de los procesos inflamatorios en la promoción de tumores. evidencias de montaje sugirieron que TNFa media muchos procesos críticos de la progresión del tumor, incluyendo activación de oncogenes, daño en el ADN, y metástasis de tumores [7].
tejido
epitelial-mesenquimal transición (EMT), una conversión fenotípica esencial durante el desarrollo embrionario, remodelación, y la cicatrización de heridas, desempeña un papel indispensable en la invasión tumoral y la metástasis [8] - [10]. EMT es un proceso reversible que a menudo se produce en la parte delantera invasiva de muchos cánceres metastásicos [11]. EMT puede ser provocada por diferentes señales recibidas de microambiente tumoral, tales como TGF, EGF, WNTs y Notch [12]. Durante los procesos de EMT, las células epiteliales de la pérdida de adhesión intercelular, adquirir características similares a fibroblastos y aumentar las propiedades migratorias e invasivas [13]. Una de las características más bien definidas de EMT es la pérdida de la expresión de E-cadherina [8]. Un grupo de factores de transcripción, incluyendo Snail, Slug, ZEB1, Twist, han sido implicados en el control de EMT [14]. Snail, un factor de transcripción zinc-finger primero identificado en Drosophila, se ha demostrado como un regulador clave de EMT [15]. Los estudios demostraron que Snail reprime la transcripción de cadherina E mediante la unión al sitio de E-box en el promotor de la E-cadherina [16] - [18]. Las funciones de caracol en la regulación de EMT se han notificado en muchos tipos de cáncer, como el carcinoma de mama, carcinoma de ovario, etc. [14], [18], [19]. El silenciamiento de caracol de interferencia por ARN estable induce la mesenquimales completa del epitelio de transición (MET) en las células MDCK-caracol, que se asocia con la inhibición de la invasión [20]. Además, la alta expresión de Snail también se correlaciona con el grado del tumor, recurrencia, metástasis ganglionar y malos resultados en los pacientes [21] - [25]. Varios mediadores inflamatorios tales como TGF, la hipoxia y la IL-6 pueden regular positivamente Snail y por lo tanto desencadenar EMT [3]. Estos resultados ponen de relieve la importancia del microambiente en la regulación de caracol y en la iniciación de la EMT.
El cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud en todo el mundo. La mayoría de las muertes por CRC se deben a metástasis que son resistentes a las terapias convencionales. EMT es un tema de gran importancia para CRC metástasis [26]. Sin embargo, el papel del TNF en la EMT de CRC casi nunca se investigan y el mecanismo molecular subyacente sigue siendo poco clara. Aquí mostramos que EMT TNFa inducida por la estabilización de Snail en HCT116 y células Caco-2. Se demostró además que TNFa estabiliza Caracol mediante la activación de AKT y por lo tanto la inhibición de la actividad de GSK-3β y la disminución de la asociación de GSK-3β y Caracol.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
NF-kB inhibidor BAY11-7082, PD98059 inhibidor de ERK, inhibidor de p38 MAPK SB-203580, inhibidor de PI3K LY294002, litio inhibidor de GSK-3β (LiCl) y el inhibidor de proteasoma MG132 se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO) . Los anticuerpos primarios contra E-cadherina, Zona ocludina 1 (ZO-1), Snail, ZEB1, p-GSK-3β (Ser9), GSK-3β, p-Akt (Ser473), Akt, y β-catenina se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (MA, EE.UU.). El anticuerpo primario contra la histona H2A.X se obtuvo de Bioworld (Tecnología Bioworld, Minneapolis, MN, EE.UU.). La proteína A /G Sepharose y los anticuerpos primarios contra N-cadherina, ubiquitina, β-actina, α-tubulina se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). El anticuerpo primario a la fibronectina se obtuvo de Boster ingeniería biológica. peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488/594 anticuerpo secundario conjugado, DAPI y lipofectamina 2000 se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Proteína recombinante TNFa humano fue comprado a PeproTech. PrimeScript® RT Kit de reactivos y SYBR Premezcla Ex Taq ™ fueron producto de Takara. E.Z.N.A® HP Kit de ARN total fue comprado a Omega Bio-Tek (Doraville, EE.UU.). piscina inteligente siRNA contra Snail humana y GSK-3β eran de RIBOBIO.
Cell Cultura y
El HCT116 y Caco-2 líneas celulares de carcinoma colorrectal se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, china). células HCT116 se mantuvieron en medio de cultivo McCoy'5a (Gibco BRL) suplementado con suero bovino fetal 10%, y las células Caco-2 se cultivaron en medio de cultivo DMEM (Gibco BRL) suplementado con suero bovino fetal al 10% bajo una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C en una incubadora.
Transwell migración y la invasión de ensayo
Migración y ensayos de invasión se realizaron en cámaras de Boyden. Los filtros de policarbonato (8 micras de tamaño de poro, Corning) pre-recubiertas con Matrigel Matrix (BD Biosciences) se utilizaron para el ensayo de invasión, y los filtros no revestidos se utilizaron para el ensayo de migración. Las células (1 × 10
5) en 300 l de medio (que contiene 0,1% de FBS) con o sin 20 ng /ml TNF se sembraron en la cámara superior. A continuación, 600 ml de medio con FBS al 10% se añadió a la cámara inferior y se desempeñó como agente quimiotáctico. Después de 24 h de incubación, la migración, las células migraron y se adhirieron a la cámara inferior se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos, se tiñeron con hematoxilina y contados bajo el microscopio en posición vertical (5 campos por cámara). Para la invasión, las células en la cámara superior fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 20 min. A continuación, el matrigel fue eliminado por medios mecánicos del filtro con un hisopo de algodón. Las células que se adhieren a la cara inferior del filtro se tiñeron con hematoxilina y se contaron bajo el microscopio en posición vertical (5 campos por cámara). Cada ensayo de migración y la invasión se repitió en tres experimentos independientes.
Gene exceso de expresión y el ARN de interferencia
Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos (2 x 10
5 células /pocillo) y se dejó en cultivo hasta el día siguiente. Luego fueron transfectadas con 2 g de plásmido vector o 100 pmol ARNsi oligómero se mezcla con el reactivo de lipofectamina 2000 en medio de suero reducido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio se cambió para completar el medio de cultivo de 6 horas más tarde, y las células se incubaron a 37 ° C en un CO
2 incubadora durante otros 24 a 48 h antes de la cosecha.
Cuantitativo PCR en tiempo real
ARNm total de las células se extrajo después del tratamiento durante el tiempo indicado. La primera hebra de síntesis de ADNc se genera a partir de 500 ng de RNA total. Cuantificación de genes de referencia (GAPDH) de destino y se realizó por triplicado en LightCycler® 480 II (Roche, Applied Science). Los cebadores utilizados en cada reacción eran como sigue: E-cadherina adelante 5'-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 'e inverso 5'-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3'; N-cadherina, adelante 5'-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 'y 5'-reverse GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3'; Caracol, hacia adelante 5'GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 'y revertir 5'-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3'; ZEB1, adelante 5'-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 'y revertir 5'GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3'; Twist, adelante 5'-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 'y revertir 5'-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3'; Slug, adelante 5'-TTCGGACCCACACATTACCT-3 'y revertir 5'-GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3'; GAPDH, hacia adelante 5'GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 'y 5'-reverse TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'. Después normalizado a gen GAPDH, los niveles de expresión para cada gen diana se calcularon utilizando el método de ciclo umbral comparativo (CT). Los valores de Ct se calcularon según la fórmula? Ct = ct (gen de interés) -CT (GAPDH) en el análisis de correlación, y el 2-ΔΔct se calculó según la fórmula ΔΔct = Ct (grupo control) -Δct (grupo experimental) para la determinación de la relación. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD) a partir de tres experimentos independientes.
análisis de transferencia Western
Las células se lavaron tres veces con solución de tampón fosfato enfriado con hielo (PBS) y luego se lisaron en tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40, 0,5% de Na-desoxicolato, 5 mg /ml de aprotinina, 5 mg /ml de leupeptina, y 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Lisados fueron aprobados por centrifugación y se desnaturalizaron por ebullición en tampón de Laemmli. Cantidades iguales de muestras de proteína se cargaron por pocillo y se separaron en geles de SDS-poliacrilamida, y después se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF. Después del bloqueo con leche desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 2 h, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (1:1,000 dilución) a 4 ° C durante la noche y después se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (dilución) para 1:5,000 2 h a temperatura ambiente. complejos inmunes específicas se detectaron mediante transferencia Western Plus quimioluminiscencia Reactivo (Ciencias de la Vida).
inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en portaobjetos de cámara, privaron de suero durante 12 h, luego se expone a TNFa para la indicada hora. Las células se lavaron tres veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y se permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 durante 10 minutos. Después de bloquear con suero de cabra durante 2 h a temperatura ambiente, las células se incubaron con anticuerpos contra E-cadherina, N-cadherina, fibronectina, ZO-1 o Snail (1:100 dilución) a 4 ° C durante la noche. Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 594 anticuerpos secundarios conjugados (1:1,000 de dilución) durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI (10 mg /ml) durante 10 min. Las muestras se examinaron con microscopía de barrido láser confocal (Zeiss) para analizar la expresión de E-cadherina, N-cadherina, fibronectina, ZO-1 y translocación nuclear de caracol.
inmunoprecipitación
Las células fueron se lavó tres veces con hielo frío PBS y se recogieron a 4 ° C en tampón de lisis inmunoprecipitación que contiene HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,5% NP-40, EDTA 2 mM, 10% de glicerol, mM Na 1
3Vo
4, mM NaF 1, ditiotreitol 1 mM, 1 mM de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo fluoruro, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina y 1 mg /ml de aprotinina. Igual cantidad de proteínas se inmunoprecipitaron usando anticuerpos anti-caracol o anticuerpo anti-GSK-3β, y los complejos inmunes fueron ligados a la proteína A /G Sepharose. Las perlas se lavaron con tampón de lisis y se sometieron a transferencia de Western con anti-ubiquitina, anticuerpo anti-GSK-3β anti-caracol o.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes a menos que se especifique lo contrario. Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos colas de Student para datos independientes entre dos grupos. Se utilizó un solo sentido el análisis de varianza ANOVA de evaluar la diferencia de medias entre los grupos. Estos análisis se realizaron usando GraphPad Prism Software Version 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
TNF promueve la migración y la invasión de las células HCT116
Las células tumorales con un fenotipo agresivo adquieren migratoria e invasiva. capacidades. Esto promoverá la difusión de células tumorales en órganos distantes [8]. Las capacidades de migración e invasión de células HCT116 afectados por TNF se midieron mediante el uso de transwell ensayos de migración e invasión. Como se muestra en la Figura 1A y C, el tratamiento TNF resultó en un aumento significativo en la migración celular y la invasión. En comparación con el control, el número de células migradas y invasivos aumentó aproximadamente 4 veces (migración) y 20 veces (invasión) después del tratamiento con TNF (Fig. 1B y D).
(A) células HCT116 eran permitido para migrar transwell cámaras durante 24 h en presencia o ausencia de TNF (20 ng /ml). Después de 24 h, se fijaron las células migraron, manchadas, y se fotografiaron. Magnificación, 100 ×. (B) El número de células migradas. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (C) Después de tratamiento con o sin TNF (20 ng /ml) durante 48 h, se fijaron las células HCT116 que se habían propagado a través de la matrixgel y en el lado inferior del filtro, se tiñe y se fotografió. Magnificación, 200 ×. (D) El número de células invasoras. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
EMT TNFa induce en las células HCT116
El aumento de las capacidades de migración e invasión de células tumorales son una reminiscencia de los eventos de la EMT, durante el cual, el fabricantes epiteliales e-cadhein y ZO-1 son las reguladas, mientras que los marcadores mesenquimales N-cadherina y fibronectina están regulados [27]. Se observó la EMT de las células HCT116 después de la estimulación con 20 ng /ml TNF durante 4 días. Las células resultaron en un cambio significativo en la morfología, de la morfología de adoquín a mesenquimales de huso como y fusiformes características (Fig. 2A). El análisis de inmunofluorescencia mostró que este cambio morfológico se asoció con la regulación a la baja de las características epiteliales E-cadherina, ZO-1 de expresión y la regulación al alza de las características mesenquimales fibronectina y la expresión de N-cadherina (Fig. 2A). Del mismo modo, el análisis de transferencia Western confirmó aún más el aumento de la expresión de la fibronectina y N-cadherina, y la expresión de la disminución de E-cadherina y ZO-1 en los niveles de proteína (Fig. 2B). Por otra parte, QRT-PCR análisis mostró que el tratamiento con TNF-regulado por E-cadherina y regulado por la N-cadherina en los niveles de mRNA (Fig. 2C). En conjunto, estas observaciones sugieren que las células HCT116 se habían sometido a una EMT después tratado por TNFa.
células HCT116 (A) se trataron con o sin TNF (20 ng /ml) durante 4 días. Teléfonos cambios morfológicos asociados con la EMT se muestran la imagen de contraste de fase en. La expresión de E-cadherina, ZO-1, la fibronectina, N-cadherina se analizaron por tinción de inmunofluorescencia. Los núcleos se visualizaron con tinción DAPI. Barras de escala: 20 m. (B) las células HCT116 se trataron con o sin TNF (20 ng /ml) durante 4 días, y la expresión de E-cadherina, ZO-1, la fibronectina, N-cadherina, Snail, ZEB1, Twist, Slug se analizó por Western secante. ß-actina servidores como el control de carga. (C) las células HCT116 se trataron con o sin TNF (20 ng /ml) durante 4 días. Los niveles de mRNA de la E-cadherina, N-cadherina, Caracol, ZEB1, Twist, Slug se analizaron mediante qRT-PCR. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
Caracol es crucial para el TNF-mediada EMT
Dado que los factores de transcripción Snail, ZEB1, Twist and Slug juegan un papel esencial en la regulación de la EMT [14] , que luego investigó si sus expresiones fueron hasta reguladas en las células HCT116 después tratados con TNFa. En comparación con las células no tratadas, TNFa aumentó significativamente el nivel de proteína Snail, pero no el nivel de ARNm (Fig. 2B y C). Sin embargo, el tratamiento con TNF alteró ni el ARNm ni los niveles de proteína de ZEB1, Twist, Slug (Fig. 2B y C).
sobreexpresa caracol para investigar más a sus papeles en EMT-TNFa inducida de células HCT116. Las células fueron transfectadas con pcDNA-Snail y control de vector pcDNA-3,1, respectivamente. La expresión de marcadores de caracol y EMT fueron detectados por inmunofluorescencia y Western Blot. Los resultados revelaron que el aumento inducido cambios morfológicos EMT-como la expresión de Snail y causaron un cambio de E-cadherina expresión de N-cadherina en las células HCT116 (Fig. 3 A y B). Estos resultados demostraron que la expresión ectópica de caracol puede desencadenar la EMT en las células HCT116. Sobre la base de estas observaciones, se evaluó que Snail regulación puede ser crucial para la EMT-TNFa inducida en células HCT116.
(A) pcDNA-Caracol (Caracol) o el control de vectores pcDNA-3.1 (vector) se expresaron en las células HCT116 de 48 h. Teléfonos cambios morfológicos asociados con la EMT se muestran la imagen de contraste de fase en. La expresión de E-cadherina y N-cadherina se analizaron por tinción de inmunofluorescencia. Los núcleos se visualizaron con tinción DAPI. Barras de escala: 20 m. (B) La expresión de E-cadherina, N-cadherina y Caracol a partir de células HCT116 transfectadas con pcDNA-caracol o vector de control fueron examinados por Western Blot. ß-actina servidores como el control de carga. Se observaron las células HCT116 (C) transfectadas con el control de si-ARN (si-Snail) o negativo específico Snail si-ARN (si-NC) se estimularon con o sin TNF (20 ng /ml) durante 48 h, y los cambios morfológicos con un microscopio de contraste de fase. células (D) HCT116 transfectadas con si-Snail o si-NC se estimularon con o sin TNF (20 ng /ml) durante 4 días, y la expresión de E-cadherina y Snail se detectaron por transferencia de Western. servidores de β-actina como control de carga.
Además, realizó ensayos de caída para verificar que Snail es un regulador clave en la EMT inducida por TNFa. HCT116 células fueron transfectadas con no director de control si-si-ARN o caracol durante 24 h, y después se trata con TNFa de tiempo diferentes. Se observaron cambios morfológicos bajo un microscopio de contraste de fase. Las expresiones de caracol y E-cadherina fueron detectados por Western Blot. En comparación con el grupo control, los cambios morfológicos de huso como no se observaron después de la adición TNFa en si-Snail células transfectadas (Fig. 3C). El silenciamiento de caracol también atenúa TNFa inducida por la baja regulación de la E-cadherina, que no se observó en las células transfectadas-ARN SI de control (Fig. 3D). En conjunto, estas observaciones demuestran que Snail es esencial para la EMT-TNFa inducida en células HCT116.
TNFa Regula la estabilización y localización subcelular de Snail
Hemos determinado anteriormente que TNFa aumenta el nivel de proteína Snail, pero no nivel de mRNA (Fig. 2B y C). Este resultado sugiere que la regulación de Snail por TNFa se estaba produciendo en el nivel post-transcripcional. A fin de verificar este punto de vista, HCT116 y Caco-2 células fueron tratadas con TNF para 0-8 h, y la proteína del caracol y el ARNm se detectaron por transferencia de Western y QRT-PCR, respectivamente. Los resultados mostraron que el nivel de proteína de Snail se mejoró después de 1 h de la estimulación TNF y aumentó en función del tiempo (Fig. 4A). Sin embargo, el nivel de ARNm de caracol no tuvo un cambio significativo después del tratamiento TNF (Fig. 4B). Estos resultados sugieren que la regulación al alza de Snail por TNFa puede ser debido a la estabilización de proteínas.
células (A-B) HCT116 y Caco-2 se trataron con TNF (20 ng /ml) durante los tiempos indicados, y la proteína (A) y el ARNm (B) niveles de Snail se examinaron mediante transferencia Western y QRT-PCR, respectivamente; (C) las células HCT116 se trataron con o sin TNF (20 ng /ml) durante 6 h. Después de la fijación, la localización celular de Snail (verde) se examinó mediante la tinción de inmunofluorescencia y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las barras de escala: 20 micras
Dado que los factores de transcripción sólo pueden surtir efecto cuando se transfieren en el núcleo [28], también se determinó la actividad de translocación nuclear de caracol por inmunofluorescencia.. La localización nuclear de Snail se evaluó en células HCT116 estimuladas con o sin TNF por 8 h. Como se muestra en la Fig. 4C, en comparación con el grupo control, TNFa aumentó significativamente la translocación nuclear de caracol.
TNFa media la Estabilización de caracol a través de la activación de Akt y la inhibición de la GSK-3β
Para investigar los mecanismos moleculares que subyace TNFa mediada Snail estabilización, se utilizaron inhibidores de NF-kappa B (BAY11-7082), PI3K /AKT (LY294002), MAPK (PD98059), p38 (SB-203580), ya que TNF puede inducir la activación de estas vías. células HCT116 y Caco-2 fueron pretratados con inhibidores durante 1 h antes de la estimulación TNF, y luego la expresión de Snail se determinó por Western Blot. Se encontró que el inhibidor de PI3K /AKT (LY294002), pero no los otros, completamente bloqueado TNF-estabilizado Snail (Fig. 5A), lo que sugiere que la activación de la vía PI3K /AKT es responsable de la estabilización Snail TNFa mediada.
vía. células HCT116 (A) se trataron previamente con SB-203580 (20 M), PD98059 (20 mM), BAY11-7082 (10 mM), LY294002 (20 M) durante 1 h seguido, respectivamente, por la estimulación con TNF (20 ng /ml) durante 6 h. La expresión de Snail se examinó por transferencia de Western. Caco-2 células fueron pretratadas con SB-203580 (20 mM), BAY11-7082 (10 mM), LY294002 (20 M) durante 1 h seguido, respectivamente, por la estimulación con TNF (20 ng /ml) durante 6 h. La expresión de Snail se examinó por transferencia de Western. (B) las células HCT116 se trataron previamente con o sin LY294002 (20 M) durante 1 h, seguido de estimulación con o sin TNF (20 ng /ml) durante 6 h. La expresión de Snail y la activación de AKT y GSK-3β se examinaron mediante transferencia Western. (C) HCT116 y Caco-2 células fueron tratadas con TNF (20 ng /ml) durante los tiempos indicados. La expresión de pGSK-3β y GSK-3β se examinaron mediante transferencia Western. (D) Control y GSK-3β si-ARN se expresaron en células HCT116 durante 42 h, seguido tratada con o sin TNF (20 ng /ml) durante 6 h adicionales. La expresión de Snail y GSK-3β se examinaron mediante transferencia Western. células HCT116 (E) se trataron con TNF (20 ng /ml) o LiCl (40 mM) durante 6 h. La expresión de Snail, pGSK-3β, GSK-3β, y β-catenina se analizaron por Western Blot. (F) Después de las células HCT116 tratadas con o sin TNF (20 ng /ml) durante 6 h, Caracol y β-catenina ubicada en la membrana nuclear y se aislaron respectivamente, y después se analizaron por Western Blot.
caracol está regulado principalmente por la GSK-3β, una quinasa situada aguas abajo de la vía PI3K /AKT [24], [29], [30]. GSK-3β mantiene un estado activo en forma desfosforilado. Para determinar si la estabilización de Snail por TNFa está mediado por la regulación de la actividad de GSK-3β, se trataron las células HCT116 con LY294002 antes de TNFa tratamiento, y luego la expresión de p-AKT, p-GSK-3β, y Snail se determinaron por Western Blot. Se encontró que los niveles de p-AKT, p-GSK-3β, y Snail se aumentaron después del tratamiento TNFa a las 6 h, mientras que estos efectos se invirtieron sobre el tratamiento con LY294002 solo o en combinación con TNF (Fig. 5B). A continuación mide la evolución temporal de la fosforilación de GSK-3β y se encontró que la expresión de p-GSK-3β aumentó de una manera dependiente del tiempo tras la estimulación TNFa en HCT116 y células Caco-2 (Fig. 5C). Estos resultados indicaron que la estabilización de Snail por TNFa se debe a la inhibición de la actividad GSK-3β. A fin de confirmar nuestros hallazgos, derribaron la expresión de GSK-3β en las células HCT116 utilizando específica de GSK-3β si-ARN (Fig. 5D). En comparación con el control, la regulación por disminución de la GSK-3β marcada elevación de los niveles de expresión de Snail (Fig. 5D). Sin embargo, mediada por TNFa estabilización de caracol no se elevó aún más después de la precipitación de la GSK-3β (Fig. 5D). De manera similar, cuando se trataron las células HCT116 con LiCl, un inhibidor de GSK-3β potente, de acuerdo con el tratamiento TNFa, las expresiones de caracol, p-GSK-3β, y β-catenina (una proteína regulada por GSK-3β) se incrementaron ( Fig. 5E). Sin embargo, la sobre regulación de β-catenina no era tan evidente como Caracol. Podría ser debido a localizaciones intracelulares entre β-catenina y caracol son diferentes. Para verificar esta hipótesis, aislamos Snail y β-catenina de membrana y nuclear de las células HCT116 tratadas con o sin TNF. Los resultados revelaron que diferente a Snail, existe β-catenina en la membrana plasmática, y TNF aumenta la translocación nuclear de Snail y β-catenina, pero no afecta a la membrana β-catenina (Fig. 5F). En conjunto, estos resultados demostraron que TNFa hasta reguladas Snail en células HCT116 mediante la activación de la señalización de AKT que conducen a la fosforilación de GSK-3β y posteriormente estabilizar Snail.
TNFa Suprime Ubiquitylation de Snail por inhibición de la Asociación de Snail y GSK-3β
Debido a que la estabilidad de la proteína de Snail se regula a través de los procesos de degradación proteasomal mediada por ubiquitina, se especuló si la estabilización de caracol por TNFa está mediada por la supresión de Snail ubiquitinación. Para probar esta hipótesis, las células HCT116 se trataron con TNF o el inhibidor del proteasoma MG132 durante 6 h, y luego Snail se inmunoprecipitó a partir la misma cantidad de lisados. El estado de ubiquitinación de Snail se detectó mediante transferencia western con un anticuerpo anti-ubiquitina. Los resultados revelaron que, en comparación con MG132, TNFa suprimió drásticamente la ubiquitylation de Snail, aunque las proteínas totales estabilizadas caracol eran paralelas (Fig. 6A). Desde GSK-3β es la principal quinasa que fosforila Caracol y luego induce la degradación de las proteínas de caracol [24], el próximo examinado la asociación de caracol y GSK-3β. células HCT116 se trataron con TNF o MG132 durante 6 h, y luego Snail se inmunoprecipitó a partir la misma cantidad de lisados, y la GSK-3β asociado se midió por el Western Blot. Como se muestra en la Fig. 6B, la asociación de caracol con GSK-3β se vio disminuida en las células tratadas con TNF, en comparación con las células tratadas con MG-132. Del mismo modo, cuando GSK-3β se inmunoprecipitó a partir de células HCT116, Associated Snail se redujo notablemente en las células tratadas con TNF, en comparación con las células tratadas con MG-132 (Fig. 6B). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el TNF inhibe la asociación de caracol con GSK-3β y posteriormente se suprimió la ubiquitinación de caracol.
(A) células HCT116 se trataron con TNF (20 ng /ml) o MG132 (10 mM ) durante 6 h. Después de Snail se inmunoprecipitó a partir de la misma cantidad de lisados (dos paneles inferiores), la ubiquitinación de Snail se examinó por transferencia de Western. (B) las células HCT116 se trataron con TNF (20 ng /ml) o MG132 (10 mM) durante 6 h. Caracol o GSK-3β se inmunoprecipitaron, respectivamente, de la misma cantidad de lisados y la GSK-3β asociado o caracol fueron detectados por Western Blot.
Discusión
Un reto importante durante el tratamiento del cáncer es metástasis inducida por la inflamación crónica. Sin embargo, los mecanismos subyacentes no se ilustran por completo. Varios mediadores inflamatorios, tales como TGF e IL-6, se ha demostrado que contribuyen a la invasión y la metástasis de cánceres [3]. TNF es una citoquina pro-inflamatoria importante que tiene una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo la inflamación, la apoptosis, la proliferación y la diferenciación celular [31]. Aunque TNF ha sido considerado como un agente contra el cáncer, actualmente se reconoce que crónicamente elevados de TNF en los tejidos puede promover el crecimiento tumoral, invasión y metástasis [32]. Hay algunos informes que la expresión de TNF se aumenta en el suero de pacientes con CRC [33]. expresión TNF también se asocia con la progresión tumoral de adenocarcinomas de colon [34]. Además, la expresión alta TNFa está fuertemente asociada con la recurrencia del tumor en pacientes con CRC positivo metastase ganglios linfáticos [34]. TNF puede ser útil como un fabricante para el diagnóstico precoz del CCR. En este estudio, se determinó un importante eje de señalización que controla las citoquinas inflamatorias e induce la EMT. A pesar del papel esencial de NF-kB en los procesos inflamatorios, hemos demostrado que se requiere AKT /estabilización mediada por GSK-3β de caracol por la EMT TNFa inducida en las células de CRC. En base a los resultados, hemos propuesto un modelo en el que TNFa hasta regula caracol a través de la activación de la señalización de AKT y por lo tanto inhibe la actividad de GSK-3β. TNF también inhibe la asociación de caracol y GSK-3β. Y luego se estabilizó TNFa transferencia de caracol en el núcleo, disminuye los responsables epiteliales E-cadherina y ZO-1 expresiones, aumenta los responsables mesenquimales N-cadherina y fibronectina expresiones, finalmente induce EMT y promueve la metástasis tumoral.
EMT se ha considerado como el primer paso de la invasión tumoral y la metástasis. Estudios recientes revelaron que los perfiles de expresión de EMT se correlacionan con los grados de tumores y metástasis de carcinoma de mama [35], [36].