Extracto
relacionada con el cáncer y el linfedema primario (LE) están asociados con la producción de tejido adiposo (AT). No se sabe nada, sin embargo, sobre las moléculas basadas en lípidos que componen LE AT. Por lo tanto, se analizaron las moléculas de lípidos en suero y lipoaspirates obtenidos de pacientes con LE, y los compararon con lipoaspirates de los pacientes de cirugía estética y suero de control cohorte saludable. LE análisis suero del paciente demostró que los triglicéridos, HDL y las moléculas de LDL-colesterol y de transporte de lípidos permanecieron dentro del rango normal, sin alteraciones en los ácidos grasos individuales. El análisis también identificó lipidomic 275 moléculas basadas en lípidos, incluyendo triacilglicéridos, diacilglicéridos, ácidos grasos y fosfolípidos en el aceite y la grasa AT. Aunque la mayoría de las moléculas de lípidos estaban presentes en una abundancia similar en LE y muestras no-LE, hubo varios cambios pequeños: aumentaron C20: 5 que contiene triacilglicéridos, reducen C10: 0 y C24 caprínico: 1 nervónico ácidos. LE AT aceite también contenía una firma de los ácidos grasos de tipo ciclopropano aumento y mediadores inflamatorios del ácido araquidónico y ceramidas. Curiosamente C20: 5 y C22: 6-de tipo omega 3 lípidos se incrementan en LE AT, en correlación con los años LE. Por lo tanto, LE AT tiene un perfil de lípidos normal que contiene una firma de la inflamación y omega-3-lípidos. No queda claro, sin embargo, si estas diferencias reflejan una perturbación pequeña escala mundial efectos metabólicos o dentro de focos inflamatorios localizados
Visto:. Sedger LM, DL Tull, McConville MJ, De Souza DP, Rupasinghe TWT, Williams SJ , et al. (2016) Lipidomic perfiles de tejido adiposo revela una firma inflamatoria en la relacionada con el cáncer y el linfedema primario. PLoS ONE 11 (5): e0154650. doi: 10.1371 /journal.pone.0154650
Editor: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, la Fundación Oswaldo Cruz, Brasil |
Recibido: 26 Febrero de 2016; Aceptado: 15 Abril de 2016; Publicado: 16 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Sedger et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Los detalles específicos de los individuos dentro de las cohortes de pacientes y donantes normales se almacena de acuerdo con las Directrices de Investigación Nacional de Salud y medicina australianos para la práctica responsable de Investigación y las directrices del Comité de Investigación Humana Institucional
Financiación:. La investigación fue financiada por el Programa de linfedema, Facultad de Medicina & amp; Ciencias de la Salud, Universidad de Macquarie. La financiación concedida a JB
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas:.. AT, el tejido adiposo; Índice de masa corporal, índice de masa corporal; Cer, ceramida; CE, éster de colesterol; DAG, diacilglicérido; GC, cromatografía de gases; HexCer, hexa-ceramida; HDL, lipoproteína de alta densidad; LE, linfedema; LC, cromatografía líquida; LDL, lipoproteína de baja densidad; LPC, liso-fosfatidilcolina; LPE, liso-fosfatidil; PBQC, agrupados de control de calidad biológica; PC, fosfatidilcolina; PCA, el análisis de componentes principales; PE, fosfatidiletanolamina; MS, espectrometría de masas; SM, esfingomielina; TAG, triacilglicéridos; VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad
Introducción
El linfedema (LE) es una condición donde el líquido linfático se acumula en los tejidos intersticiales que causan la inflamación. En los países desarrollados LE más a menudo se produce como consecuencia de, o "secundaria a", el tratamiento para el cáncer. Los pacientes de cáncer con mayor riesgo de desarrollar cáncer relacionado LE incluyen pacientes con cáncer de mama que requieren linfático estadificación nodo o tratamiento (biopsia del ganglio centinela más /menos la disección y /o radiación axilar, y, a menudo con la quimioterapia) debido a la metástasis del cáncer [1]. De hecho estimaciones conservadoras indican que hasta un 28% de estos pacientes en los países desarrollados se desarrollará brazo LE con posterioridad a su tratamiento contra el cáncer de mama [1]. Del mismo modo, hasta el 75% de los pacientes con cáncer de cabeza y cuello puede desarrollar la garganta, la cara, el cuello o LE interno [2] y un tercio de los pacientes con cáncer pélvico desarrollará miembro inferior LE dentro de 1 año de la cirugía [3]. Por lo tanto, LE relacionada con el cáncer es ampliamente aceptada como una de las complicaciones más frecuentes a largo plazo del tratamiento del cáncer. Primaria LE también puede ocurrir espontáneamente, por lo general presenta por primera vez durante la infancia, y, a menudo con un origen genético [4] o como resultado de lesiones de tejidos no relacionados con el cáncer. Por lo tanto se produce LE debido al drenaje linfático comprometido que puede ser causada directamente por, o contribuyó al por lesiones o alteraciones genéticas que conducen a defectos en la biogénesis de los vasos linfáticos o malformaciones en la formación de la válvula de vaso linfático y la reducción de la función linfática [4]. Por desgracia, actualmente no existe una cura para la primaria o secundaria LE (relacionada con el cáncer). Por lo tanto, LE es una condición crónica que afecta a la capacidad de una persona para vivir una vida normal debido a que la condición tiende a empeorar con el tiempo y la desfiguración física y la discapacidad funcional en la calidad de vida [5,6].
Uno de los principales problemas asociados con LE crónica es que los tejidos afectados se convierten en frecuencia consolidado con el tejido adiposo (AT) [7,8]. Una vez que esto ocurre cumplimiento a los tratamientos convencionales que comprenden la compresión, vendajes y masaje a menudo disminuye a medida que se hace evidente que no pueden reducir la LE-AT asociado que entonces predomina dentro de la zona afectada. Afortunadamente, hay una opción de tratamiento quirúrgico para las personas que viven con el avanzado rico en AT LE: la cirugía de liposucción [9-12], que elimina físicamente el AT que predomina la zona afectada [7,8]. Aunque este tratamiento es altamente beneficioso para los pacientes con LE, reducir inmediatamente la LE afectada tamaño de las extremidades, las razones para la producción de AT LE siguen surgiendo y la patología LE se conocen por completo [13]. Por lo tanto, aunque está claro que la adipogénesis normalmente implica citoquinas, hormonas, factores de transcripción, y miRNAs que regulan la expresión génica temporal para conducir la maduración de los preadipocitos en adipocitos que contienen lípidos maduros [14,15], sin embargo, muy poco se sabe actualmente sobre la adipogénesis dentro de la propia AT LE. No se sabe nada, por ejemplo, sobre los tipos de moléculas basadas en lípidos que se producen por los adipocitos del tejido LE. Curiosamente, AT es realmente integral al sistema inmune de los mamíferos y, de hecho, los ganglios linfáticos existen normalmente en estrecha asociación física con AT, donde la lipólisis libera ácidos grasos libres y de lípidos-mediadores que las células del sistema inmune de combustible [16]. Además, mientras que el colesterol es normalmente transportado en la sangre a través de las lipoproteínas, ya sea como los quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), intermedio o lipoproteínas de alta densidad (HDL), el transporte de los lípidos de nuevo a partir de células y tejidos en el hígado se produce a través de HDL y la linfa, un proceso conocido como transporte inverso del colesterol [16]. Aquí, el eflujo de colesterol celular se libera en el espacio intracelular aunque las acciones combinadas de los transportadores ABC, scavenger receptor-B1, CYP27A1, caveolina, o difusión pasiva (cada mecanismo de variación dependiendo en parte del tipo de célula) [17], en los que es en última instancia eliminado por el HDL y de trata de nuevo desde el intersticio a través de los vasos linfáticos (para una revisión reciente ver [18]). Por lo tanto, el transporte de lípidos es necesariamente integral a LE porque el drenaje linfático se altera cuando se quitan los ganglios linfáticos, o cuando los vasos linfáticos y las válvulas están dañados o mal funcionamiento. De hecho, los estudios basados en animales recientes sugieren deteriorados transporte inverso del colesterol se produce en murina inducida experimentalmente LE [19]. Si hay defectos en el transporte inverso del colesterol en LE humana, entonces el grado en que se altera o desequilibrada metabolismo de los lípidos no están claros. Así, también, se sabe poco sobre las consecuencias de la inflamación crónica de la LE en el nivel de lípidos séricos y lipoproteínas asociadas a lípidos en LE humano. Por lo tanto para comenzar a comprender mejor la patobiología de la producción en la diferencia horaria LE se examinaron los lípidos séricos y experimentalmente generamos el primer EN perfil lipídico de los pacientes avanzados LE relacionados con el cáncer y los comparó con suero normal, y al brazo y pierna normal con ajuste anatómico , no LE, AT.
Materiales y Métodos
Ética de la Investigación humana Aprobación
Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité Ético de Investigación humana de la Universidad de Macquarie (HREC) antes a su iniciación. Todos los elementos del estudio se llevaron a cabo posteriormente de acuerdo con la HREC protocolos aprobados, de manera que todos los donantes de tejidos normales y pacientes con LE, donó su sangre y AT muestras de liposucción voluntariamente y con consentimiento informado por escrito.
Paciente y saludable control de los participantes estudian los criterios de inclusión
Todos los pacientes con LE (n = 15, Tabla 1) fueron en busca de la evaluación médica y el tratamiento de las extremidades avanzada LE en la Clínica de evaluación avanzada linfedema en el hospital de la Universidad de Macquarie. Estos pacientes suelen presentarse con una diferencia de volumen de la extremidad de al menos & gt; 20-25% y se ofrecen cirugía de liposucción en base a la presencia de LE-participen, en la determinada principalmente por un "no-picaduras" presentación LE [8,20] y confirmado por resonancia magnética [9]. Por lo tanto la cirugía de liposucción es una opción de tratamiento para los pacientes que han experimentado recientemente beneficio insignificante de los tratamientos convencionales LE debido a la acumulación consolidada de cantidades sustanciales de AT. Para la comparación con el tejido normal también obtuvimos brazo humano sano y la pierna (miembro) AT (n = 7; Tabla 1). Este tejido se obtuvo de pacientes de cirugía estética que habían optado por la cirugía de liposucción en una clínica de cirugía estética Melbourne privada por razones personales no declarados. Una imagen de ejemplo de la extremidad LE paciente y el LE y no LE lipoasparates se muestra (Fig 1). Todos los pacientes con LE y donantes sanos también proporcionaron sus mediciones de peso y altura, que fueron utilizados para calcular el índice de masa corporal del individuo (IMC) y por lo tanto para permitir la identificación y exclusión de los participantes del estudio que podrían de otro modo no serían clasificadas por tener un "índice de masa corporal normal, ', que según la Fundación corazón de Australia de escala de clasificación (http://heartfoundation.org.au/). Por lo tanto, todos los participantes en el estudio estaban dentro del rango normal IMC normal (15 & lt; 25), a excepción de dos pacientes con LE que tenían un índice de pre-cirugía de masa corporal (IMC) & lt; 30 kg /m
2. Sin embargo, estos dos pacientes con LE no se consideraron obesos debido a que el índice de masa corporal de un paciente regresó a & lt; 30 kg /m
2 rápidamente después de la liposucción extremidad, y el otro tiene la pierna primaria LE afecta tanto a las extremidades, es decir, claramente estos pacientes datos prequirúrgicos reflejan sus extremidades linfedematosos en lugar de una condición de la obesidad generalizada del cuerpo. También era evidente que varios individuos en tanto LE y LE cohortes no eran "sanos pero con sobrepeso" (IMC = 25-29), en consonancia con muchas características demográficas de los países occidentales actuales (datos individuales no presentados). Un análisis estadístico de los datos de las características de cohortes, específicamente la edad, el sexo y el IMC, se llevó a cabo a través de la prueba t de Student estándar con ningún supuesto de normalidad de la distribución de datos dado el relativamente pequeño tamaño de las muestras (Tabla 1).
(A ) brazo izquierdo LE, (B) pierna izquierda LE, (C) LE EN liposucción aspirar y (D) normal no LE (cirugía estética) EN aspirado de la liposucción, que muestra la presencia de aceite líquido (aceite) y grasa sólida (grasa). También es evidente la capa acuosa de la solución salina de lavado dentro del aspirado de la cirugía estética.
Recogida de muestras y procesamiento de tejidos
La cirugía de liposucción para el cáncer-relacionada LE se realizó bajo anestesia general la anestesia en el hospital de la Universidad de Macquarie por el autor TL que fue especialmente entrenado por el profesor y el profesor Brorson Munnoch, que han desarrollado lo que ahora es un procedimiento bien establecido para la avanzada LE [10-12,21]. La cirugía fue realizada en los brazos y las piernas (figura 1A y 1B) afectados-LE después de la aplicación de un torniquete. Brevemente, AT subcutánea se eliminó a través de múltiples incisiones pequeñas situadas a lo largo de la longitud de la extremidad afectada, a través de una cánula Helixed Tri Puerto III (por lo general 22 a 30 cm de largo y 4-5 mm de ancho) conectado a una bomba de vacío [9]; el mismo procedimiento ha sido empleado con éxito internacionalmente por más de una década [10-12]. El brazo o la pierna LE EN lipoaspirado extraída (figura 1C) fue transportado inmediatamente a la Facultad de Medicina y Laboratorios de Investigación de Salud, procesada como se describe a continuación y almacenado a -80 ° C en una batería en la muestra generada por el LMS. miembro humano sano (brazo o pierna) AT se recogieron con el consentimiento informado del donante, en una clínica privada de cirugía estética, el Dr. Lanzer Clínica, Melbourne, desde los clientes que optan por someterse a una cirugía de liposucción. En pocas palabras, un tejido lipo-aspiración de salud (figura 1D) se obtuvo mediante procedimientos de cirugía plástica estándar bajo anestesia general. Después se hicieron pequeñas incisiones, los alrededores se llenó de líquido tumescente de Klein usando una aguja de calibre 20, antes de aplicar succión y la posterior extracción de AT a través de un calibre 14 Klein microcánula de la variedad capastrano [22]. los pacientes de cirugía de liposucción cosmética continuación, use una abrazadera de compresión de forma continua durante aproximadamente 2 semanas, a continuación, de forma intermitente durante 2 semanas después de la operación, con el fin de minimizar la posibilidad de eventos adversos o complicaciones post-quirúrgicas [23].
El LE y (cosmética) cirugía normal de liposucción AT lipoaspirates (Fig 1C y 1D) se vierte en varios 50 ml tubos Falcon y se centrifugó a aproximadamente 350 g durante 5 minutos para separar el "aceite de grasa" líquido de los sólidos adipocitos AT es decir, intactas intactas se refiere de otro modo aquí como AT "grasa". También se recogieron los componentes del tejido acuosas subyacentes restantes, y se desechó el sedimento de eritrocitos en sangre. Después de la centrifugación, el aceite se retiró y se almacenó congelado a -80 ° C. A continuación, los adipocitos intactos, y las capas acuosas, se retiraron cuidadosamente, por separado, y se colocan de manera similar en tubos separados y se congelaron inmediatamente también a -80 ° C. Por lo tanto, los componentes del tejido se almacenaron en el momento de su recogida quirúrgica durante un período de 12 a 18 meses a través hasta que un solo descongelación para posteriores análisis de laboratorio.
muestras de sangre periférica se recogieron de pacientes LE usando tanto SST-II y tubos de recogida de vacutainer K
2EDTA inmediatamente antes de la anestesia para la cirugía de liposucción. La sangre periférica también se obtuvo de edad sanos no relacionados con el sexo y los donantes emparejados (n = 13; Tabla 1) por venopunción estándar de venas periféricas, realizados por flebotomistas capacitados. Todos los pacientes con LE y donantes sanos que eran "ayuno" y "reposo"; que consumen ningún alimento, y no ejercían durante al menos 8-10 horas antes de la punción venosa o AT colección por cirugía de liposucción. Muestras de sangre periférica se centrifugaron durante 10 minutos y el suero y plasma () capas eliminadas, alícuotas, a continuación, se almacenaron congeladas hasta que una sola descongelación para análisis de laboratorio.
análisis bioquímico automatizado para todos los lípidos séricos
los lípidos séricos totales se midieron como sigue: colesterol se midió con un ensayo de colesterol enzimático (Abbott), triglicéridos con un ensayo de glicerol fosfatasa oxidasa base (Abbott), y HDL-colesterol con el ensayo de detergente selectivo acelerador Ultra HDL (Abbot) y se analizaron en un instrumento Arquitecto c16000 Abbott en Douglas Hanly Moir Patología, Macquarie Park, Sydney. Los niveles de colesterol LDL se calcularon como sigue: LDL-colesterol = colesterol-HDL (0,45 x triglicéridos), que es esencialmente similar tanto a las formulas Friedewald y Amhadi [24,25]. La apolipoproteína A1 y los niveles séricos -B se determinaron mediante ensayos inmunoturbidimétricos Tina-Quant apolipoproteína A-1 Ver 2 y apolipoproteínas B Ver 2 (Roche), usando el analizador 800 de Roche Integra en el Laboratorio de Sullivan y Nicolaides en Brisbane, Australia. El rango normal generalmente aceptada de estas moléculas en el suero humano se observa junto con los datos.
cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) análisis de ácidos grasos
AT muestras de aproximadamente 50 mg eran se extrajo en 1 ml de cloroformo: metanol (2: 1 v /v) por incubación en un Thermomixer (Eppendorf) durante 10 min a 30 ° C, después se centrifugó a 18000g durante 5 min a 4 ° C. Una parte alícuota de 50 ul del sobrenadante de cada muestra también se combinan para crear un control de calidad biológica agrupada (PBQC). Las muestras individuales y PBQC (5 ul) se transfirieron a una placa de vidrio a la que se añadieron 40 ul de patrones internos: cloroformo: metanol (2: 1 v /v) que contiene 62,5 uM de cada uno de
13C
18-estearato de y
13 C
2-miristato. normas de ácidos grasos de cadena lineal (Sigma) (25 uM) y las normas de ácidos grasos monometílico de cadena ramificada y de tipo ciclopropano (25 uM) se sintetizaron en casa como se ha descrito anteriormente [26,27] y preparado en cloroformo: metanol (2: 1). Insertos que contienen muestras de AT y el PBQC se sellaron en viales de GC y el método de transesterificación para crear ésteres metílicos de ácidos grasos. Por esta muestras se mezclaron con 5 uL Methprep-II (Alltech), utilizando un inyector automático robot Gerstel MPS2, se incubaron durante 30 min a 37 ° C con agitación lenta para la mezcla. análisis de ácidos grasos se realizó en un cromatógrafo de gases Agilent 7890 acoplado a un detector selectivo de masas 5975. Las muestras (2 ul) se inyectaron en modo dividido (10: 1) en una entrada fija en 250 ° C y la separación cromatográfica se consiguió en una columna SGE BPX70 (60 m x 0,25 mm de diámetro interno x 0,25 um de espesor de película). Las condiciones del horno eran 70 ° C durante 1 min, luego 40 ° C /minuto a 150 ° C, 4 ° C /minuto a 200 ° C, 3 ° C /minuto a 220 ° C, 4 ° C /min a 250 ° C luego se mantuvo a 250 ° C durante 4 minutos. flujo de gas portador helio era constante a 1,5 ml /min y la línea de transferencia MS se fijó en 280 ° C. Los compuestos se ionizan mediante la fragmentación por impacto de electrones (-70eV) y los espectros de masa recogida en todo el rango /z 50-450 m en 3,6 lecturas /segundo.
Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) análisis de lípidos
análisis de lípidos LC-MS se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con los métodos estándar descritos anteriormente para los lípidos en sangre [28]. En pocas palabras, la grasa de aceite (~ 50 mg "aceite") y-grasa sólida (~ 50 mg "grasa") muestras fueron extraídas con 1 ml de cloroformo: metanol (2: 1, v /v) que contiene el patrón interno 5 uM C17 : 0 LPC durante 1 hora a RT. Los extractos se centrifugaron a 18.000 g durante 10 minutos a 4 ° C (en una microcentrífuga refrigerada) y los sobrenadantes se transfirieron a un nuevo tubo. El sedimento se volvió a extraer con cloroformo 500 ul: metanol (2: 1, v /v), se centrifugó como se describió anteriormente y los sobrenadantes combinados. Los extractos de grasa de aceite y sólido en grasa se secaron bajo gas nitrógeno y luego se resuspendieron en 100 ul butanol: metanol (1: 1) que contiene formiato de amonio 5 mM (Sigma). Los lípidos se analizaron mediante cromatografía líquida de un sistema 1200 de Agilent (LC) y triple cuadrupolo espectrómetro de 6460 de masas (MS). Brevemente, los lípidos se separaron mediante la inyección de 5 ul de la muestra en un 50 mm x 2,1 mm x 2,7 m Ascentis expreso columna RP-amida (Supelco) seguido de la elución a un caudal de 0,2 ml /min en un gradiente de 5 min de agua /metanol /tetrahidrofurano (50:20:30, v /v /v) de agua /metanol /tetrahidrofurano (5:20:75, v /v /v) con el tampón final celebrada por 3 min. Los lípidos se identificaron mediante espectrometría de ionización electrospray de masas utilizando un método que se ha optimizado el uso de un panel de estándares de lípidos auténticos. la identificación de los lípidos se llevó a cabo usando dos funciones de análisis disponibles en el espectrómetro de masas de triple cuádruple, una exploración de precursores y exploración pérdida neutra. Ambas exploraciones se perfiles de identificación de masas precursoras de las especies de lípidos basados en la m /z del fragmento del grupo de cabeza. Fosfatidilcolinas (PC) y esfingomielinas (SM) se identificaron mediante la búsqueda de precursores a 184,1 m /z, mientras que las ceramidas (CER), ésteres de colesterol (CE) y fosfatidilgliceroles (PG) fueron identificados mediante la búsqueda de precursores a 264,6, 369,4 y 189 m /z respectivamente, todos en el modo MS positivo. Fosfatidiletanolaminas (PE) se identificaron mediante la búsqueda de pérdida neutra 141 m /z en modo MS positivo. Diacilglicerol (DAG) y triacilglicerol (TAG) se identificaron utilizando exploraciones pérdida neutra de posibles restos acilo graso. Así, las identificaciones de lípidos son putativo y la mayoría no han sido validados por otros medios. Los lípidos se cuantificaron mediante el uso de monitorización de reacción múltiple con tensión capilar 4000V, voltaje fragmentador 140 a 380 V, la energía de colisión 15 a 60 V y gas de colisión (nitrógeno) a 7 L /min. La cuantificación se basa en los cambios relativos en las áreas de pico
El manejo de datos y el análisis estadístico
cadena lineal especies de lípidos se refered de manera uniforme a través de la Cx:. Y nomenclatura que se refiere al número total de carbonos (x) y el número de enlaces dobles (y) en el lípido. Por ejemplo, CE de ésteres de colesterol (14: 1) tiene 14 átomos de carbono y 1 doble enlace nota que la posición del doble enlace no está definido. estudios de ácidos grasos de cadena ramificada incluyen acidsm iso-graso que contiene un grupo metilo en la penúltima carbono. Por lo tanto, iso-C15: 0 se refiere a ácido 13-metilmirístico. Los ácidos grasos de ciclopropano estudiados incluyen cis-9,10-methylenehexadecanoic ácido (MHA), ácido dihyrosterculic (DHS) y ácido lactobacillic (LBA). La nomenclatura y clasificación de los lípidos se ajusta a la de LIPD MAPAS http://www.lipids.org. Tanto los datos de GC y LC-MS se procesaron utilizando Agilent misa Hunter cuantitativa Software (B.06.00). Los datos en bruto que indican la abundancia relativa (área bajo la curva) se analizaron en Microsoft Excel (Versión 14.5.9 para Mac OS), el cálculo de la desviación media, estándar (SD) y la mediana de LE o datos de cohortes normales. Los datos en bruto fue primer registro transformado, a continuación, modificar mediana de normalización (x /mediana) [29], donde el valor medio determinado como individualmente para cada clase de lípidos incluidos en el estudio (por ejemplo, ácidos grasos, DAG, TAG, CE, PE /LPE , SM, Cer, etc), con el fin de dar cuenta de la naturaleza de los datos heteroscedastic metabolómica. Cuando un lípido fue detectado un valor cero fue reemplazado por "0" o "1" para permitir el análisis de aguas abajo (datos en bruto, las células en caja en los datos suplementarios). La media y DS se calcularon de nuevo esta vez de la transformación logarítmica de los datos de la mediana normalizada, y diferencias significativas entre LE normal en comparación con las muestras, evaluaron cada uno para especies de lípidos, identificados mediante la prueba t de Student para datos independientes una de dos colas; la significación estadística p & lt; 0,05, sin supuestos para la distribución de datos (normalidad). Global-mediana de los datos normalizados también se analizaron de forma independiente para permitir un análisis de componentes principales (PCA) que evaluó las diferencias globales entre todos los metabolitos dentro de cada una de las cohortes de muestras de forma simultánea; los PCA se realizaron con el paquete R y los resultados se pueden encontrar en la figura S1. Los datos se examinaron adicionalmente para identificar posibles descubrimientos falsos utilizando el método de corrección de Benjamini-Hochberg [30]. Por último, los datos se analizaron para la correlación de años LE por el método de correlación de Pearson usando GraphPad Prism (versión 60F para Mac OS X), con la correspondiente R
2 valores tabulados junto con
p Hotel & lt; 0,05 como indicador de significación. Los datos se graficaron con figuras prisma y multicomponentes de datos se construyeron en la lona Draw 2 (versión 1.01) para Mac OS.
Resultados
Total de lípidos séricos en avanzado LE
Para determinar si existe algún desequilibrio metabólico basado en lípidos sistémica asociada con la extremidad a la deposición en crónica avanzada relacionadas con el cáncer LE, se analizaron 15 sueros de pacientes LE (Tabla 1) para el total de los niveles de colesterol y triglicéridos circulantes, y se comparó 13 sexo sano normal emparejado suero de donantes sanos. Los niveles en suero de estas moléculas fueron muy similares en los pacientes LE como estaba presente en sanos, no LE, donantes de sangre, y ambas cohortes contenían varios individuos con hipercolesterolemia, es decir, los individuos con niveles de colesterol por encima de los niveles recomendados para individuos sanos, es decir, por encima de la "normal rango "(figura 2A). A pesar de estas similitudes, se encontró que los niveles de colesterol HDL en suero a ser menor (estadísticamente significativo, p = 0,0340) en los pacientes LE en comparación con las muestras de la cohorte de donantes sanos, aunque estas muestras estaban aún dentro del rango normal (Fig 2A). Los niveles de colesterol LDL calculados fueron también similares entre la LE y muestras de cohortes normales (figura 2A), al igual que las moléculas de transporte de lípidos séricos, apolipoproteína A1 y apolipoproteína B (figura 2B). Por lo tanto, la abundancia de los lípidos séricos totales y las moléculas de lípidos de transporte son en gran parte sin cambios en comparación con avanzados LE donantes normales, y dentro del rango normal para los adultos saludables relacionados con el cáncer.
parcelas (A) de cajas y bigotes de colesterol total en suero, triglicéridos, colesterol-HDL y colesterol-LDL calculado, y (B) de lipoproteínas de suero total apoproteína A1 y apolipoproteína B, de paciente LE (n = 15) y la cohorte normal (n = 11) periféricos muestras de sangre. La línea dentro de cada cuadro indica el valor de la mediana mundial calculada a partir de la cohorte. El rango normal de la población generalmente aceptada (NR) se muestra dentro de cada gráfico (línea vertical, lado derecho). La significación estadística (
p valor
) entre LE y normal (no-LE) también se muestran, como se determinó mediante la prueba t de dos colas, no asumiendo igualdad de varianza.
Suero el análisis de lipidomic LE pacientes
Debido a que estos ensayos de laboratorio de rutina de diagnóstico rápido no proporcionan información sobre el tipo o la abundancia de especies de lípidos individuales, 7 elegidos al azar muestras de pacientes LE y 3 (sanos) muestras de suero de donantes "normales" se analizaron adicionalmente mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Esto permitió la identificación molecular específica de algunos ácidos grasos 31 en el suero humano, incluyendo 4 ácidos grasos de cadena ramificada, este último no se analizan con frecuencia en otras publicaciones que investigan los lípidos séricos. No obstante, y en consonancia con el total de los niveles de lípidos en suero, no se encontraron ácidos grasos séricos individuo a estar presentes en el suero del paciente LE con una abundancia alterada que estaba presente en el "control" saludable (-LE no) de suero de cohortes (datos muestran ahora; S1 archivo de datos; Hoja de "suero"). También se realizó un análisis de componente principal (PCA), pero, como se esperaba, no hubo diferencias globales significativos fueron evidentes entre el LE y muestras de suero normales, ya que todos los puntos de datos cohorte LE y normales fueron ampliamente inter-disperso (datos no mostrados). Tomados en conjunto con el análisis sérico total de lípidos se ha descrito anteriormente, estos datos indican que la presencia de grandes cantidades de AT dentro de las extremidades afectadas-LE de avanzada extremidades relacionada con el cáncer pacientes con LE no da como resultado diferencias detectables en los perfiles o niveles de sangre circulante -born lípidos, según la evaluación de estos métodos. Además, este resultado se alinea estrechamente con la abundancia normal de las proteínas de transporte de suero de apolipoproteína A1 y B en el suero LE (mencionado anteriormente, la figura 2).
linfedema tejido adiposo (AT) análisis lipidomic
a pesar de la falta de diferencia en los lípidos séricos totales, que sigue siendo desconocido si la propia AT lE consistió en el perfil lipídico molécula inusual, o un abundancia relativa alterada en comparación con la extremidad humana normal AT. Por lo tanto, se analizaron molecularmente tanto el AT sólido ( "grasa") que comprende tejido adiposo ricos intacta, así como el aceite de adipocitos ya liberado (aceite es decir, la grasa; denominará en lo sucesivo como "aceite") presente en lipoaspirates obtenidos de pacientes con LE someterse a una liposucción la cirugía, y se compara esto con el aceite de grasa y grasa presente en los lipoaspirates obtenidos de individuos sanos sometidos a liposurgery por razones cosméticas. Es de destacar que todas las muestras fueron lipoaspirado anatómicamente emparejados, es decir, todos eran brazo o una pierna AT y tanto el sólido a la grasa, el aceite y la grasa, se analizaron por separado por GC-MS y LC-MS. Esto permitió la identificación y cuantificación simultánea relativa (log transformado abundancia relativa media normalizada) de unas 275 moléculas basadas en lípidos, incluyendo: 25 diacilglicéridos, 66 triacilglicéridos, ácidos grasos 34, y 150 fosfolípidos de diversas clases, en el aceite de grasa y grasa en muestras de tejidos humanos. lipoaspirado
en primer lugar, hemos utilizado LC-MS para identificar diacilglicéridos (DAG) y lípidos (TAG) triacylglyceride tanto en LE y la integridad física AT normal. Aunque la mayor parte del DAG y etiquetas que fueron identificados en el aceite y la grasa humana de LE AT estaban presentes en abundancia similar a la detectada en las extremidades AT normal (es decir, entre -0.1 a +0,1 reduzca o se incremente la comparación de LE a la normalidad), había varios especies de lípidos que se incrementaron de forma individual estadísticamente significativamente o reducirse en LE en comparación con el tejido sano (Fig 3A y 3B, y File S2 de datos). Si bien estos cambios eran cada una bastante pequeña, parecía que la mayor parte de los aumentos fueron en las etiquetas con ácidos grasos poliinsaturados, y en especial los que contienen 3 o más átomos de carbono insaturados (barras blancas), especialmente ácido eicosapentaenoico C20: 5 (barras grises), tanto en la grasa y el aceite LE AT (figura 3A y 3B). Además, cuando estos datos se combinan entre sí que parecía que puede haber un aumento global en las etiquetas que contienen ácidos grasos poli-insaturados y una reducción concomitante en menos grasas saturadas, tal como di-, mono-, o grasas completamente insaturados, en LE AT (figura 3C). Sin embargo, en los mamíferos, los ácidos grasos poli-insaturados C20 se sintetizan generalmente a partir de ácido linoleico con fuente dietética (C18: 2) y alfa-linenic ácido (C18: 3) a través de la acción de desaturasas de ácidos grasos y elongasas, y la enzima proximal producir tanto C20 del ácido araquidónico: 4 y el ácido eicosapentaenoico C20: 5, a partir de sus respectivos precursores C18: 2 y C18: 3, respectivamente, es el delta-5 desaturasa. Por el contrario, los ácidos grasos mono-saturada dependen de desaturasas estearoil-CoA reductasa. Por lo tanto, no queda claro si estos pequeños cambios individuales en concreto DAG y las etiquetas son biológicamente significativa es decir, si (i) que reflejan cambios reales en el metabolismo de los lípidos, tales como un aumento de la delta-5-desaturasas y o reducción de la actividad desaturasa /estearoil-CoA reductasa, que posteriormente o de forma concomitante resultar en aumento de la producción de la C20 de ácido eicosapentaenoico a base de ácidos grasos omega-3 anti-inflamatoria: 5, o alternativamente (ii) si estos pequeños efectos son simplemente dentro de ámbitos de variación, especialmente fondo dada su pequeña magnitud y falta general de significación estadística tras el análisis de corrección de BH. Sin embargo, una primera conclusión razonable es que la LE AT parece tener un perfil lipidomic notablemente similar a la no-LE AT (excepto por el mayor contenido de C20: 5 TAGs que contienen), y que el aceite de LE que se libera de asemeja adipocitos rotos el aceite que está presente dentro intactas en los adipocitos (grasa), al menos con respecto a la DAG y el contenido de TAG.