Extracto
BBF2H7 es un retículo endoplasmático (ER) -Residente transmembrana cremallera de leucina básica (bzip) factor de transcripción que es escinde en el dominio de transmembrana por proteolisis intramembrane regulada en respuesta al estrés ER. El citoplásmico N-terminal escindido que contiene activación de la transcripción y los dominios de bZIP se transloca en el núcleo para promover la expresión de los genes diana. En los condrocitos, el luminal escindido C-terminal es extracelular secretada y facilita la proliferación de las células vecinas a través de la activación de la señalización de Hedgehog. En el presente estudio, encontramos que
Bbf2h7
niveles de expresión aumentaron significativamente por 1,070 a 2,567 veces en varios tipos de tumores, incluyendo glioblastoma en comparación con aquellos en los respectivos tejidos normales, utilizando la base de datos de perfiles Oncomine cáncer. En algunas líneas celulares de cáncer dependientes de ligando Hedgehog incluyendo células de glioblastoma U251MG, la BBF2H7 C-terminal se secreta a partir de células en el medio de cultivo y promovió la proliferación de células de cáncer a través de la activación de la señalización de Hedgehog. Desmontables de
Bbf2h7
expresión suprime la proliferación de células U251MG mediante la regulación negativa de señalización Hedgehog. La proliferación celular alterada y la señalización de Hedgehog se recuperaron mediante la adición de BBF2H7 C-terminal al medio de cultivo de las células
Bbf2h7
-knockdown U251MG. Estos datos sugieren que el luminal secretada BBF2H7 C-terminal está implicada en la proliferación de células de cáncer dependiente de ligando Hedgehog través de la activación de la señalización de Hedgehog. Por lo tanto, la BBF2H7 C-terminal puede ser una nueva diana para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer
Visto:. Iwamoto H, Matsuhisa K, Saito A, Kanemoto S, Asada R, Hino K, et al. (2015) Promoción de la proliferación de células cancerosas por escindido y se secreta luminal dominios de ER estrés transductor BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10.1371 /journal.pone.0125982
Editor Académico: María Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
Recibido: 15 de diciembre de 2014; Aceptado: March 27, 2015; Publicado: May 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Iwamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Takeda Ciencia, la Fundación médica Yasuda la Fundación Nakajima, la Fundación Tokio Investigaciones Bioquímicas, Fundación Kobayashi Internacional de becas de la Fundación NAGASE Ciencia Tecnología , la Fundación Mitsubishi, Fundación Grupo SEI RSE y la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (25/677, 25251014, 25650069, 25861324, 24300135, 26460099). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el retículo endoplásmico (ER) es el orgánulo celular central responsable de la síntesis, el plegamiento y modificaciones postraduccionales de las proteínas destinadas a la vía secretora. Diversas condiciones patofisiológicas, tales como el agotamiento de calcio ER, el estrés oxidativo, la hipoglucemia, la expresión de proteínas mutantes y la hipoxia, interferir con el plegamiento correcto de las proteínas, y misfolded o proteínas desplegadas se acumulan en el lumen del RE. Tales condiciones, que se denominan colectivamente estrés ER, tienen el potencial de inducir daño celular. El ER responde a estas perturbaciones mediante la activación de una vía de transducción de señales integrado llamado a la reacción proteína desplegada (UPR) [1,2]. La activación de la UPR conduce a transitorios atenuación de traslación para disminuir las exigencias que en el ER, la inducción de la transcripción de genes que codifican las chaperonas ER-residente para facilitar el plegamiento de proteínas, y la degradación asociada-ER (ERAD) para degradar las proteínas desplegadas que se han acumulado en el ER. En células de mamíferos, hay tres transductores de estrés ER bien establecidos: ARN de doble cadena dependiente de la proteína quinasa retículo endoplásmico quinasa (PERK), inositol-enzima que requiere-1 (IRE1), y la activación de factor de transcripción 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK fosforila directamente la α-subunidad del factor de iniciación eucariótico (eIF2α), que conduce a una dramática reducción en la síntesis de proteína celular [6]. A la inversa, y, paradójicamente, la fosforilación de eIF2α también regula al alza la expresión de ATF4 [1]. ATF4 transactivates la expresión de la proteína pro-apoptótica, C /EBP-proteína homóloga (CHOP), proteínas pro-supervivencia, como ER chaperones, y las proteínas de estrés antioxidantes [7]. IRE1 procesa formas sin empalmar de
X-box-proteína de unión-1 gratis (
Xbp1
) ARNm para generar formas de corte y empalme del ARNm [4,8]. XBP1 proteínas derivadas de las formas empalmadas de
Xbp1
ARNm inducen la expresión de ER chaperones residente y moléculas relacionadas con el ERAD. ATF6 se escinde en su dominio de transmembrana por proteasas sitio-1 y -2 (S1P y S2P, respectivamente) en respuesta al estrés ER [5,8]. El ATF6 N-terminal escindido se transloca en el núcleo e induce la expresión de ER chaperones residentes para facilitar el plegamiento de proteínas.
Además de los tres transductores de estrés ER canónicas, hay nuevos tipos de transductores de estrés ER que comparten dominios de alta similitud de secuencia con ATF6. Estos factores de transcripción tienen activación de la transcripción y los dominios de cremallera de leucina básica (bZIP) en su N-terminal e incluyen BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /lzip /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] y CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. Uno de los miembros de la familia OASIS, BBF2H7, se expresa preferentemente en condrocitos [15,16]. BBF2H7 se escinde en el dominio de transmembrana por proteolisis intramembrane regulado (RIP) en respuesta al estrés ER. El citoplásmico N-terminal escindido que contiene los dominios de activación y de transcripción bZIP se transloca en el núcleo para promover la expresión de genes diana incluyendo
Sec23a
[15]. En contraste, la escindido C-terminal es extracelular secretada y directamente se une tanto a Indian hedgehog (Ihh) y su receptor, patched-1 (Ptch1), seguido por la activación de Hedgehog (Hh) de señalización [16]. La vía mediada por el BBF2H7 C-terminal desempeña un papel en la proliferación de condrocitos en el desarrollo del cartílago. Las funciones de ambos los extremos N- y C-terminal son esenciales para el desarrollo de cartílago ratón.
Se requiere
señalización Hh para la diferenciación celular y la formación de órganos durante la embriogénesis [17]. En el adulto, la señalización de Hh se mantiene activa en algunos órganos en los que está implicada en la regulación de mantenimiento y proliferación de células madre. En los mamíferos, la vía de señalización Hh es iniciada por tres ligandos Hh Sonic hedgehog ([Shh], Desert hedgehog [Dhh] y Ihh) [18]. ligandos Hh se unen al receptor transmembrana Hh, Ptch1. En ausencia de ligandos Hh, Ptch1 inhibe la función de la proteína transmembrana, Smoothened (Smo), que activa oncogén glioma asociado 1 (Gli1) [19,20]. Una vez ligandos Hh se unen a Ptch1, Smo se libera de la inhibición y promueve la activación del factor de transcripción Gli1. Activado Gli1 inicia la transcripción de genes diana Hh como
Gli1
,
forkhead cuadro L1 gratis (
foxl1
),
Ptch1
,
ciclina D1
y
La ciclina E1
[21].
señalización Hh también está involucrado en la promoción del cáncer. Los pacientes con síndrome de Gorlin (o síndrome del nevo de células basales) han heredado mutaciones que inactivan Ptch1, lo que lleva a la señalización Hh constitutivamente activa en ausencia de ligandos Hh [22]. Estos pacientes tienen una alta incidencia de carcinomas de células basales (CCB), un tumor de la piel de los queratinocitos, además de los meduloblastomas y rabdomiosarcomas. Casi todos los casos de CBC esporádicos son causadas por la activación de la vía de señalización Hh a través de la pérdida de heterocigosidad Ptch1 y /o inactivar o la activación de mutaciones en Smo, que disminuyen su inhibición por Ptch1. Además, varios tipos de cáncer dependientes de ligandos Hh que implican la sobreexpresión de ligandos Hh se han identificado en los últimos años, incluyendo de pulmón, pancreático, de mama y de próstata [23,24]. En todos los casos, estos tipos de cáncer responden a ligandos Hh de una manera autocrina. ligandos Hh secretadas a partir de células de cáncer actúan sobre las células que secretan (o células de cáncer de vecinos) para estimular la proliferación celular y /o la supervivencia, lo que lleva al crecimiento del tumor. Por lo tanto, los inhibidores específicos de la señalización de Hh pueden servir como agentes contra el cáncer. Sin embargo, no queda claro cómo ligandos Hh, su receptor de Ptch1 y la señalización aguas abajo están reguladas en las células cancerosas.
Como se mencionó anteriormente, el BBF2H7 C-terminal activa la señalización de Hh uniéndose directamente a ambos ligando Hh y Ptch1, que promueve la proliferación celular. Curiosamente, el
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gen fue identificado por primera vez como el socio de
fusionado en el sarcoma gratis (
FUS
) en un gen quimérico que se encuentra en bajo grado sarcoma fibromixoide (LGFMS) [25]. Los informes recientes han demostrado que Hh Hh y genes diana están regulados por incremento en pacientes LGFMS [25,26]. Por lo tanto, la hipótesis de que BBF2H7 puede tener un papel importante en la proliferación de células cancerosas dependientes de ligandos Hh. Aquí, encontramos que el BBF2H7 C-terminal escindido se secreta de ciertos tipos de células cancerosas y promueve la proliferación celular a través de la activación de la señalización de Hh.
Materiales y Métodos
conjuntos de datos de microarrays para Oncomine
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expresión
microarrays de datos para el glioblastoma (El Atlas del Genoma del cáncer-glioblastoma multiforme y el cerebro de grado inferior del glioma del ADN número de copias de datos de 2013), el carcinoma ductal de mama invasivo (carcinoma de mama El cáncer invasivo Atlas del Genoma La expresión de genes de datos de 2011), el carcinoma escamoso de cuello uterino [27], el adenocarcinoma de próstata [28], adenocarcinoma de colon [29], el adenocarcinoma gástrico (del Genoma del cáncer Atlas-estómago adenocarcinoma ADN número de copias de datos de 2013), y el adenocarcinoma de páncreas (El cáncer el adenocarcinoma de ADN del genoma Atlas-pancreático Número de datos de copia, 2013) se accede utilizando la base de datos de perfiles Oncomine cáncer (versión 4.4.4.4, www.oncomine.org) para investigar
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expresión en diversos tipos de cáncer.
cultivo de células
HEK293T (derivada de riñón embrionario humano; American Type Culture Collection [ATCC]),
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- /- fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, deriva de
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- /- ratones usando protocolos publicados anteriormente [15 ]), MCF7 (derivada de cáncer de mama humano; ATCC) y HeLa (derivadas de cáncer cervical humano; las células ATCC) se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (Life Technologies) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS). LNCap (derivada de cáncer de próstata humano; ATCC) las células se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute medio-1640 (Life Technologies) que contiene 10% de FBS. U251MG (derivado de glioblastoma humano; JCRB banco de células) y LS174T (derivada de cáncer de colon humano; ATCC), las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (DS Pharma) que contiene 10% de FBS. Para aliviar el estrés ER, las células cancerosas fueron tratados con 4-fenilbutirato de (4-PBA; WAKO), una chaperona química. Para inducir estrés ER, las células cancerosas se trataron con 1 thapsigargina M. (TG; WAKO), un inhibidor de la ER Ca
2 + -ATPasa
El aislamiento de ARN, la transcripción inversa-PCR (RT-PCR) y cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total se aisló mediante el método de guanidina fenol utilizando ISOGEN (Nippon Gene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Partes alícuotas de 1 mg de ARN purificado fueron transcritas inversa en ADNc de primera cadena en un volumen de 20 l de reacción usando 200 virus de la leucemia murina Moloney U transcriptasa inversa (Life Technologies) [30]. PCR se realizó usando los conjuntos de cebadores específicos en un volumen total de 20 l que consiste en 1 l de ADNc, 0,5 M de cada cebador, dNTPs 0,2 mM, 1 U de ADN polimerasa (Agilent), y tampón de PCR (Agilent). El primer secuencias fueron los siguientes:
Gli1
hacia adelante, 5'-GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 ';
Gli1
inversa, 5'-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 ';
foxl1
hacia adelante, 5'-ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 ';
foxl1
inversa, 5'-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 ';
Xbp1
hacia adelante, 5'-ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 ';
Xbp1
inversa, 5'-GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 ';
β-actina
hacia adelante, 5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 ';
β-actina
inversa, 5'-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 '. los parámetros del ciclo de PCR fueron 20 s a 94ºC, 20 s a 58 ° C, y 25 s a 72 ° C durante 18-33 ciclos (
Gli1
, 33;
foxl1
, 31 ;
Xbp1
, 25;
β-actina
, 18), seguido de 72 ° C durante 5 min. Las alícuotas (5 l) de cada mezcla de reacción se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 4,8%. La densidad de cada banda se cuantificó usando Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).
Para analizar los niveles de expresión de ARNm, cuantitativa en tiempo real PCR se realizó con 480 Light Cycler System II (Roche) y Light Cycler SYBR Green I master (Roche). Las reacciones de PCR se realizaron usando el kit KAPA SYBR qPCR RÁPIDO optimizado para la luz Cycler 480 (KAPA). Todos los resultados se normalizaron a la expresión de
β-actina
mRNA endógeno y se expresaron como aumentos relativos o disminuciones en la expresión en comparación con los controles.
Western blotting
Las proteínas se extraído de las células utilizando tampón de lisis celular (1% Triton X-100, EDTA 100 mM, NaCl 50 mM, HEPES 10 mM, sacarosa 500 mM, y un cóctel inhibidor de la proteasa [MBL Internacional]). Las concentraciones de proteína de los lisados celulares se determinaron usando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo). Igual cantidad de proteína se sometieron a electroforesis en 12% geles de SDS-poliacrilamida, y después se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad). Para la inmunotransferencia, se usaron los siguientes anticuerpos y diluciones: policlonal de conejo anti-BBF2H7 C-terminal (Abcam; 1: 1000), ratón policlonal anti-BBF2H7 N-terminal (el anticuerpo generado [15]; 1: 1000), ratón monoclonal anti-β-actina (Sigma; 1: 3000), policlonal de conejo anti-interleucina 6 (IL-6) (Abcam; 1: 250), alcalina IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa (Sigma; 1: 3000), y alcalina conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón (Enzo; 1: 3000). Las proteínas marcadas se detectaron utilizando cloruro de nitro-azul de tetrazolio (WAKO) y la sal de p-toluidina 5-bromo-4-cloro-3'-indolylphosphatase (Roche).
inmunoprecipitación
Para detectar BBF2H7 C-terminal en el medio de cultivo, los sobrenadantes de cultivo se incubaron con anti-BBF2H7 N-terminal, anti-BBF2H7 C-terminal, o anti-IL-6 anticuerpos durante la noche. Las muestras se precipitaron entonces con cuentas de proteína G agarosa (Life Technologies), seguido de Western Blot. IL-6 se utilizó como control de carga.
La inmunohistoquímica
Se recogieron muestras de tumor durante la cirugía del Hospital de la Universidad de Hiroshima, congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Las secciones se fijaron en acetona fría a -20 ° C y luego en una solución tampón de fosfato de paraformaldehído al 4%. Para la inmunotinción de BBF2H7 C-terminal, se utilizó un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal como el anticuerpo primario y Kit Dako Envision (Agilent) para la detección de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con el Comité Ético de Investigación del Genoma Humano de la Universidad de Hiroshima.
Plásmidos y transfección
BBF2H7 humano de longitud completa, N- y C-terminal ADNc se obtuvieron mediante romos ligación de extremos de los productos de PCR correspondientes a los aminoácidos 1-520, 1-377 y 431-520 (GenBank Número de Acceso, NP_919047.2) con un (proteína de unión a inmunoglobulina) secuencia de péptido señal de BiP (aminoácidos 1-16, número de acceso GenBank , NP_005338.1) en el extremo N-terminal. La larga duración BBF2H7, N- y C-terminal ADNc se clonaron en un (+) vector pcDNA3.1. células HEK293T y
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- /-. MEFs se transfectaron con cada plásmido utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante
Los bioensayos de la proliferación de células
U251MG células (1 × 10
5) se sembraron en placas de 6 cm, se cultivaron a 37 ° C durante 24 h, y luego transfectadas con huevos revueltos o
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pequeños ARN de interferencia (siRNA) utilizando Lipofectamine 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para
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caída, se utilizaron las siguientes secuencias: 5'-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 '(siBBF2H7-1) y 5'-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3' (siBBF2H7-2). células U251MG se incubaron a 37 ° C durante 24 h después de la transfección, y a continuación, se reemplazó el medio de cultivo. El número de células se contaron en los días indicados después de la transfección. siRNAs fueron adquiridos de Bioneer (Daejeon, Corea del Sur).
Además, después de la transfección con huevos revueltos o
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siRNAs,
Bbf2h7
-knockdown U251MG células fueron expuestas a un medio acondicionado recogido a partir de células HEK293T transfectadas con un vector vacío (Mock) o BBF2H7 C-terminal (C-Sup.), o para C-Sup. en el que BBF2H7 C-terminal se tira hacia abajo por inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab.). El número de células se contaron en los días indicados después de la transfección. Para el ensayo de proliferación celular, que también se utiliza un kit de recuento de células (WST-8 ensayo, DOJINDO) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para confirmar la activación de la señalización de Hh por BBF2H7 C-terminal, las células se trataron con U251MG Shh recombinante (R & amp; D Systems), ciclopamina (WAKO) o purmorphamine (WAKO)
Análisis estadístico
las comparaciones estadísticas entre dos muestras se hicieron usando de Student
t
. -prueba.
P & lt
valores; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
La expresión de BBF2H7 en los tumores y la secreción de su escindido C-terminal de las células cancerosas
El
Bbf2h7
gen fue identificado por primera vez como el socio de
FUS
en un gen quimérico que se encuentra en LGFMS [25]. Por lo tanto, es posible que BBF2H7 pueden estar involucrados en la proliferación de células cancerosas. Se examinaron los niveles de expresión de
Bbf2h7
en diversos tipos de tumores utilizando la base de datos de perfiles Oncomine cáncer (figura 1A). Los conjuntos de datos incluyen 37, 61, 5, 28, 94, 94 y 8 muestras de tejido normal, y 582, 389, 40, 59, 52, 173 y 32 muestras de tejidos malignos de glioblastoma, carcinoma de mama ductal invasivo, carcinoma escamoso de cuello uterino, de próstata adenocarcinoma, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma gástrico y adenocarcinoma de páncreas, respectivamente. Como se muestra en la figura 1A,
Bbf2h7
niveles de expresión mostraron un aumento significativo de 1,070 a 2,567 veces en varios tipos de tumores en comparación con los de sus respectivos tejidos normales. Por el contrario, no había ninguna regulación al alza significativa de
Bbf2h7
expresión en los adenocarcinomas gástricos o pancreáticos, lo que indica que la expresión génica de
Bbf2h7
se mejoró específicamente en ciertos tipos de tumores.
(a) El aumento de expresión de
Bbf2h7
en los cánceres humanos. Se accedió a datos de microarrays de tumores en la base de datos de perfiles Oncomine cáncer (versión 4.4.4.4, www.oncomine.org). Los diagramas de caja que muestran una mayor expresión de
Bbf2h7
durante la tumorigénesis de varios tipos de cáncer se construyeron a partir Oncomine. El eje y representa el registro
2 intensidad centrado en la mediana (expresión normalizada). La línea dentro de la caja representa el valor medio de expresión para cada grupo, y los bordes superior e inferior de la caja se incluye la 75
y 25
º percentiles de la distribución, respectivamente. Las líneas (filamentos) de cada caja se extienden a la 90
y 10
º percentiles de la distribución. Los puntos negros fuera de los extremos de los bigotes representan las mayores y más pequeños puntos de datos. Los diagramas de caja que representa la distribución de los
Bbf2h7
expresión dentro de cada muestra y de Student
t-test
dando un
P
valor para la comparación de
Bbf2h7
expresión entre las muestras normales y malignas de tejido se obtuvieron directamente a través de Oncomine. muestras de tejido de colon normal incluyen colon ascendente, el colon descendente y el recto. (B) pronosticó características de péptidos de BBF2H7 humano. activación de la transcripción, se indican cremallera de leucina básica (bZIP) y dominios transmembrana, así como un sitio de sitio-1 proteasa (S1P). (C) En condiciones de estrés ER, BBF2H7 se transporta desde el RE al aparato de Golgi y se escindió en el sitio de S1P [9]. El BBF2H7 N-terminal escindido actúa como un factor de transcripción mediante la unión al elemento de respuesta de AMP cíclico (CRE) de los genes diana [15]. En contraste, la escindido BBF2H7 C-terminal se secreta extracelularmente [16]. (D) transferencia de Western de la longitud completa endógeno BBF2H7 y el extremo N- o C-terminal de BBF2H7 usando lisados de células (panel izquierdo) o medios de cultivo (panel derecho) de varias líneas celulares de cáncer humano. BBF2H7 N-terminal, BBF2H7 C-terminal o IL-6 en los medios de cultivo se inmunoprecipitó usando anti-BBF2H7 N-terminal (panel superior), anti-BBF2H7 C-terminal (panel central), o anti-IL--6 anticuerpos ( panel inferior), respectivamente. β-actina o IL-6 se utilizó como controles de carga. análisis (E) RT-PCR de
Xbp1
la expresión de ARNm en diversas líneas celulares de cáncer humano.
Xbp1-s Opiniones y
Xbp1-u
indican formas empalmados y sin empalmar de
Xbp1
, respectivamente. Tenga en cuenta que
Xbp1-s se detectó en todas las líneas celulares de cáncer, lo que indica que estas células están experimentando estrés ER. análisis (F) RT-PCR de
Xbp1
la expresión de ARNm en células U251MG tratados con 2 mM 4-PBA, una chaperona química, por 3 h. (G) La cuantificación de
Xbp1-s
expresión en F. Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0.01. (H) transferencia de Western de BBF2H7 en células U251MG tratados con 1 thapsigargin mu M (TG), un inhibidor de ER Ca
2 + -ATPasa, por 6 h. (I) La inmunohistoquímica de secciones de cerebro de pacientes de glioblastoma utilizando un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal específica. Señales fuertes se detectaron tanto en el citosol de las células cancerosas (indicadas con una punta de flecha) y en su espacio circundante extracelular (indicado con flechas). El panel izquierdo muestra una magnificación baja, y el panel derecho muestra un aumento mayor del panel de la izquierda. Las barras de escala indican 50 micras (panel izquierdo) y (panel derecho) 10 micras.
BBF2H7 se escinde en el dominio transmembrana en respuesta al estrés ER (Fig 1B y 1C) [9]. La N-terminal promueve la expresión de los genes diana incluyendo
Sec23a
[15]. En contraste, el C-terminal se secreta de las células y facilita la proliferación de las células vecinas a través de la activación de la señalización de Hh en condrocitos [16]. A continuación, se analizó la expresión de larga duración y su BBF2H7 escindido N- y C-terminal en lisados de las siguientes líneas celulares de cáncer: U251MG glioblastoma, el cáncer de mama MCF7, cáncer cervical HeLa, cáncer de próstata LNCaP y LS174T cáncer de colon. Detectamos el 80 kDa de longitud completa y su BBF2H7 escindido N-terminal (50 kDa) y C-terminal (20 kDa) en los lisados de casi todas las líneas celulares de cáncer, excepto las células LS174T (Fig 1D). BBF2H7 C-terminal, pero no de longitud completa BBF2H7 o su N-terminal, también se detectó en los medios de cultivo de estas líneas celulares, lo que indica que el C-terminal escindido se secreta a partir de estas células en el medio de cultivo. La escisión de BBF2H7 depende de estrés ER [9]. Por lo tanto, hemos comprobado si las líneas celulares de cáncer fueron sometidos a estrés ER. Como se muestra la figura 1E-1G, las formas empalmadas de
Xbp1
[8], un marcador de estrés ER, se observaron en todas las líneas celulares de cáncer. El tratamiento de células U251MG con 4-PBA [31], una chaperona química, disminución de las formas empalmadas de
Xbp1
en los niveles basales y de estrés ER aliviado, lo que indica que las células cancerosas que nos registramos estaban bajo condiciones de estrés ER. Además, confirmamos que BBF2H7 se escindió en respuesta al estrés ER en las células cancerosas (Fig 1H). Estos datos mostraron que BBF2H7 se escindió y su C-terminal fue secretada extracelularmente en respuesta al estrés ER bajo homeostasis en estas líneas celulares de cáncer, excepto para las células LS174T. A continuación, para confirmar que la proteína BBF2H7 se expresa en los tumores, se realizó inmunohistoquímica utilizando secciones de cerebro de pacientes de glioblastoma y un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal específica (Fig 1I). Señales fuertes se detectaron tanto en el citosol de las células cancerosas y en su espacio extracelular circundante. Estos resultados indicaron que BBF2H7 fue altamente expresado en glioblastoma y que el C-terminal escindido fue secretada extracelularmente a partir de células cancerosas.
proliferación de células cancerosas de una manera dependiente de Shh-
Se sabe que BBF2H7 C-terminal se une tanto a ligando y su receptor Hh, Ptch1, y promueve la señalización de Hh [16]. Para examinar si las líneas celulares de cáncer con el crecimiento celular elevada BBF2H7 muestran mayor expresión y la activación de la vía de señalización Hh de una manera dependiente de ligando, que tratan estas líneas celulares de cáncer con Shh recombinante (Fig 2A-2C). El tratamiento con Shh recombinante resultó en la regulación positiva significativa de Hh genes diana tales como
Gli1
y
foxl1 Hoteles en BBF2H7 que expresan las líneas celulares de cáncer y el crecimiento celular mejorada. Sin embargo, las células LS174T, que no expresan BBF2H7, no mostraron respuesta al tratamiento con Shh recombinante. Estos resultados sugieren que las cuatro líneas celulares de cáncer que secretan BBF2H7 C-terminal han mejorado el crecimiento celular de una manera dependiente de Shh-
.
(A) Análisis de RT-PCR de Hh genes diana en varias líneas celulares de cáncer tratados con 500 ng /ml de Shh recombinante durante 48 h. (B) Cuantitativo en tiempo real PCR análisis de los genes diana Hh expresión en A. Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. líneas de células (C) El cáncer se cultivaron durante 5 días después del tratamiento con 500 ng /ml 5. Las barras de error Shh y analizados por WST-8 ensayos en día recombinantes representan la media ± SD de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0.05.
BBF2H7 C-terminal aumenta la señalización de Hh en células de cáncer
Como se muestra en la figura 1A y 1D, BBF2H7 fue elevada en algunos tumores y líneas celulares de cáncer. Se examinó el papel de los BBF2H7 N-terminal y C-terminal en la proliferación celular mediante la transfección de los vectores de expresión en células cancerosas. BBF2H7 N-terminal apenas se ve afectada la proliferación celular, lo que indica que el extremo N-terminal no tiene el potencial de promover la proliferación celular en las células cancerosas. Por el contrario, BBF2H7 de longitud completa y C-terminal ligeramente mayor proliferación celular en comparación con el control, sin embargo, las diferencias no fueron significativas (datos no mostrados). La producción de BBF2H7 de longitud completa y C-terminal por los vectores de expresión puede no ser lo suficientemente alta para promover significativamente la proliferación celular. Creemos que la BBF2H7 de larga duración producido y C-terminal de los vectores de expresión que tenían un menor efecto sobre la proliferación celular, porque BBF2H7 endógena fue altamente expresado en células U251MG. Por lo tanto, transfectadas BBF2H7 humano de longitud completa, N- o C-terminal en
Bbf2h7
- /- MEFs [15], cuya proliferación celular fue afectada en comparación con los MEF tipo salvaje, para eliminar las efectos de BBF2H7 endógena sobre la proliferación celular (Fig 3A y 3B). La transfección de BBF2H7 de longitud completa o C-terminal en
Bbf2h7
- /- MEFs restauró la proliferación celular, sin embargo, la transfección de BBF2H7 N-terminal sola no mejoró la proliferación celular, lo que indica que el humano BBF2H7 C -terminal, pero no el N-terminal, tiene el potencial de promover la proliferación celular
(a, B)
Bbf2h7
-. /- MEFs se cultivaron durante 5 días después de la transfección con BBF2H7 de longitud completa (completa), N-terminal (N), C-terminal (C) o un vector vacío (Mock), y se analizaron por recuento de células en el día 5 (a) y WST-8 ensayo a la hora indicada puntos (B). WT y KO indican MEF tipo salvaje y
Bbf2h7
- /- MEF, respectivamente. Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. (C) Análisis de RT-PCR de Hh genes diana en varias líneas celulares de cáncer expuestas a medio condicionado recogido de las células HEK293T transfectadas con BBF2H7 C-terminal (C-Sup. +) O un vector vacío (C-Sup.-) para 48 marido. análisis (D) Cuantitativo PCR en tiempo real de Hh expresión de genes diana en C. Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. análisis (E) RT-PCR de Hh genes diana en células U251MG tratados con C-Sup., C-Sup. agotado de BBF2H7 C-terminal mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab.), o C-Sup. en presencia de 5 mM de ciclopamina (C-Sup. + CPN). Mock indica medio condicionado recogido de las células HEK293T transfectadas con un vector vacío. análisis (F) Cuantitativo PCR en tiempo real de Hh expresión de genes diana en E. Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. células U251MG (G, H) se cultivaron durante 5 días después de acondicionado de tratamiento medio y analizados por recuento de células en el día 5 (G) y WST-8 ensayos en los días indicados (H). Las barras de error representan la media ± DE de cinco experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01.
El BBF2H7 C-terminal secretado se ha informado que la promoción de la proliferación celular de los condrocitos a través de la activación de la señalización de Hh [16]. Para investigar más los efectos de la secretada BBF2H7 C-terminal sobre la proliferación de células de cáncer, las líneas celulares de cáncer se expusieron a medio condicionado recogido de las células HEK293T transfectadas con humano BBF2H7 C-terminal (C-Sup.) Que contiene una secuencia de péptido señal de BiP en su N-terminal, para permitir su secreción a partir de células. El tratamiento de las líneas celulares de cáncer con C-Sup. dado lugar a la regulación positiva significativa de Hh genes diana, como
Gli1
y
foxl1
, en todas las líneas celulares, excepto para las células LS174T (Figura 3C y 3D). En particular, las células U251MG y LNCaP mostraron inducción más significativa de Hh genes diana, lo que indica que los efectos de la C-Sup. en la señalización Hh eran diferentes entre las líneas celulares de cáncer. Para confirmar que el BBF2H7 C-terminal secretado promovió la proliferación celular a través de la activación de la señalización de Hh, se examinó si la señalización de Hh en células U251MG todavía se activaría después de la depleción de BBF2H7 C-terminal de C-Sup. por inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-BBF2H7 C-terminal (C-Sup. + Ab .; Fig 3E-3H). Como era de esperar, el agotamiento de BBF2H7 C-terminal de C-Sup. causado una disminución significativa en la expresión de Hh genes diana y en la proliferación celular. Además, el tratamiento con ciclopamina (CPN) [32], un antagonista que inhibe Smo Smo y su señalización Hh aguas abajo, cancela los efectos de la C-Sup. en la inducción de genes diana Hh como
Gli1
y
foxl1 gratis (Figura 3E y 3F). Por otra parte, la promoción de la proliferación celular por C-Sup. fue suprimida por el tratamiento con CPN (Fig 3G y 3H), lo que sugiere que la BBF2H7 C-terminal secretado actúa aguas arriba de Smo y mejora Hh proliferación dependiente de ligando.
Efectos de
Bbf2h7
siRNA en *
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