Extracto
Antecedentes
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF) es capaz para eliminar las células cancerosas a través de la muerte celular mediada por el receptor que requieren trifosfato de adenosina (ATP). el uso clínico de TNF hasta ahora se limita en gran medida por su profunda hepatotoxicidad. Recientemente, se ha descubierto en el sistema murino que la protección específica de los hepatocitos contra los efectos perjudiciales de TNF se puede lograr por el agotamiento de ATP en fructosa mediada por el mismo. Antes de emplear este principio de selección bastante atractivo en un primer ensayo clínico, que aquí investigamos exhaustivamente la interdependencia entre el agotamiento del ATP y hepatotoxicidad TNF en ambos
in vitro
y
ex vivo
experimentos basados en el uso de primaria materiales de tejido de pacientes.
Métodos
hepatocitos humanos primarios, y las rebanadas de tejido hepático primario derivadas del paciente tanto no tumorales y tumorales se utilizaron para dilucidar el agotamiento de ATP inducida por fructosa y la citotoxicidad inducida por TNF.
resultados
PHH, así como cortes de tejidos preparados a partir de muestras de hígado humano no malignas sometidos a una depleción de ATP en fructosa mediada fueron ambos demostraron ser protegidos contra la muerte celular inducida por el TNF. Por el contrario, debido a la sobreexpresión específica de tumor de hexoquinasa II, que impone un bypass profundo en el catabolismo de la fructosa-hepatocitos específica, esto no fue el caso de los tejidos del hígado tumorales humanas.
Conclusión
Normal tejidos de hígado humano se pueden proteger transitoriamente contra la muerte celular inducida por el TNF por el pretratamiento sistémica con fructosa utilizado en concentraciones no tóxicas /fisiológicos. TNF-focalización de los tumores primarios y secundarios en el hígado por el agotamiento transitoria y específica de hepatocitos ATP selectiva abre una nueva vía clínica para el tratamiento a base de TNF de los cánceres de hígado
Visto:. Weiland T, K Klein, Zimmermann M, Speicher T, Venturelli S, Berger A, et al. (2012) La protección selectiva del tejido hepático humano de TNF-focalización de los cánceres de hígado por Transitoria El agotamiento de trifosfato de adenosina. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10.1371 /journal.pone.0052496
Editor: Johannes Haybaeck, Universidad de Medicina de Graz, Austria |
Recibido: 9 Agosto, 2012; Aceptado: 19 Noviembre 2012; Publicado: 18 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Weiland et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por conceder ICEPHA 2009-09, la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF,#0315755) y la Fundación Robert Bosch, Stuttgart, Alemania. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el uso sistémico de la antineoplásico altamente potente factor de necrosis tumoral citoquinas (TNF) es muy limitada
debido a la constatación de que las funciones pleiotrópicos de TNF inducen efectos secundarios sistémicos graves
, en particular, la toxicidad hepática de alto grado [ ,,,0],1], [2]. Por lo tanto, la administración sistémica de TNF fue sustituida en entidades tumorales seleccionados con éxito por los regímenes que emplean solamente perfusiones locales de extremidades con TNF [3], [4]. Sin embargo, tales estrategias se mantuvieron difícil de alcanzar para la perfusión hepática aislada (PHI) que se utiliza para el tratamiento de tumores malignos del hígado [5] - [8].
Recientemente, la apoptosis de hepatocitos inducida por TNF fue reconocido como altamente ATP proceso que depende en un modelo murino [9]. Además, hay pruebas de que la fructosa conduce al agotamiento de ATP exclusivamente en hepatocitos. Como consecuencia funcional, los hepatocitos (en contraste con sus homólogos malignos) exhiben protección hacia la apoptosis inducida por TNF [9], [10]. Esta diferencia biológica entre los hepatocitos y las células malignas se atribuyó a una sobreexpresión relacionados transformación de hexoquinasa II (HKII) que conduce a una derivación de la fructosa-catabolismo hepatocítica específicos [10]. En presencia de fructosa, las enzimas críticas específicas del hígado ketohexokinase (KHK) y aldolasa B (ALDOB) establecen una, trampa reversible hepatocitos específicos de ATP [11]. La sobreexpresión de HKII no pasa por este fregadero
de manera que
la fructosa se convierte preferentemente en fructosa-6-fosfato y se metaboliza a través de "muscular de tipo" glucólisis sin afectar los niveles celulares de ATP (representado en detalle en la figura 1).
el aumento de expresión de la hexoquinasa II (HKII) en células tumorales da como resultado un metabolismo de tipo muscular de la fructosa (parte inferior de la imagen), que no abarca ninguna agotamiento o atrapamiento de ATP. Por el contrario, los hepatocitos (parte superior de la imagen) utilizan las enzimas ketohexokinase (KHK) y aldolasa B (ALDOB) y por lo tanto un metabolismo hepático de tipo de fructosa. Como resultado, hay una conversión dependiente de ATP muy rápida de la fructosa a través de KHK a la fructosa-1-fosfato que actúa como un disipador de fosfato con lo que drásticamente los niveles celulares de ATP.
En el nivel molecular,
este efecto protector específico de hepatocitos fructosa mediada por TNF hacia
es más probable alcanzado por los productos de degradación de ADP, que se acumulan en forma de adenosina. Recientemente,
se demostró que la adenosina provoca una adenosina autocrina 3 ', 5'-monofosfato cíclico respuesta
, afectando negativamente a la actividad inducida por TNF de la quinasa c-Jun N-terminal (JNK) en una proteína quinasa A -dependiente [12].
En nuestro estudio, se investigó la posibilidad de transferir este enfoque a partir de datos murinos al sistema humano en relación con el agotamiento de ATP en fructosa transitoria mediada y efectuar con ello el desarme selectiva de TNF de destructiva hepatocíticas propiedades. Con este fin, hemos utilizado (i) en cultivo de hepatocitos humanos primarios (PHH) y, (ii) la precisión de corte rebanadas de tejidos hepáticos humanos sanos
frente a los tejidos hepáticos humanos malignos derivados de resectates hígado de los pacientes en una traslación e
x vivo
enfoque. Además de la experimentación murino realizado previamente, w
e ahora eran capaces de traducir los conocimientos adquiridos sobre la protección hepática mediada por la fructosa en el contexto fisiológico humano que proporcionen la base para la futura fase I /II de estudios clínicos
.
Materiales y Métodos
declaración ética
hepatocitos primarios humanos, cultivadas (PHH) son transformados a base de muestras tomadas del hígado recién obtenidos en la cirugía hepática. En consecuencia, PHH no constituyen una línea celular; PHH son células primarias. PHH de diferentes pacientes donantes fueron proporcionados por T. S. Weiss con el consentimiento informado del paciente con respecto a la toma de muestras de acuerdo con las directrices de y aprobado por la controlada por el estado de caridad Tejidos Humanos & amp; Investigación de la célula Fundación, HTCR (para información directa por favor vaya a: http://www.htcr.de/english/supply.html)., Y por A. y M. Königsrainer Schenk (Dpto del general, visceral & amp; cirugía de trasplante del hospital Universitario de Tubinga, Alemania) con el consentimiento informado del paciente con respecto a la toma de las muestras aprobadas por el Comité de Ética local (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Clínica Universitaria de Tubinga /Comisión de Ética de la Facultad de medicina de Eberhard-Karls al-Universidad y el hospital de la Universidad de Tübingen Clínica). Los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. El comité de ética Tubinga aprobó este procedimiento de autorización y el comité de ética Tubinga no planteó ninguna objeción en contra de este estudio. resectates hígado y tumores de hígado humano se obtuvieron con el consentimiento informado del paciente desde el Dpto. del general, visceral & amp; La cirugía de trasplante del Hospital Universitario de Tübingen, Alemania, de acuerdo con las directrices del Comité de Ética local. Los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio (es decir, donación de la pieza quirúrgica al tumor Tubinga y el banco de tejido normal). Este proceso fue documentado por la firma de la información del paciente respectivo. El comité de ética Tubinga aprobó este procedimiento de autorización y el comité de ética Tubinga no planteó ninguna objeción en contra de este estudio (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Clínica Universitaria de Tubinga /Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Eberhard- Karls-Universität Tübingen y el hospital de la Universidad). Sin investigación se realizó fuera de nuestro país de residencia.
Cultivo de células
hepatocitos humanos primarios se cultivaron en DMEM suplementado con 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Serva, Heidelberg, Alemania), 18.8 g /ml de hidrocortisona (Merck, Darmstadt, Alemania) y 1,68 mU /ml de insulina (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca). líneas de células tumorales se cultivaron en DMEM suplementado con suero de ternera fetal 10%. Todas las células se cultivaron en una incubadora humidificada con 37 ° C y 5% de CO
2. HepG2 se obtuvieron de ATCC, Hep3B y PLC /PRF /5 se obtuvieron de ECACC y HuH7 se obtuvieron de Riken Gene Bank. identidades de células fueron probados por la tipificación de ADN (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Todas las células se probaron ser negativos para la contaminación por micoplasma.
De corte de tejido
precisión de corte
El rebanar de las muestras de tejido se inició una hora después de la resección en un vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Alemania) en hielo frío tampón de Krebs-Henseleit saturada de oxígeno (KHB) que contiene 25 mmol /l de glucosa (Merck, Darmstadt, Alemania), 25 mmol /l de NaHCO
3 y 10 mmol /l HEPES (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) después de el almacenamiento en Custodiol (Franz Köhler Chemie, Alsbach, Alemania) [21]. Los cortes se incubaron en oxigenada William E medio que contiene 25 mmol /l de glucosa y 50 mg /ml de gentamicina (Lonza Bioscience, Verviers, Bélgica) en una atmósfera oxigenada (80% de oxígeno, 5% de CO
2).
Sustancias
recombinante TNF alfa humano se adquirió de Innogenetics (Gante, Bélgica). Fructosa y ActinomycinD (ActD) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania).
El tratamiento de células y tejidos humanos rebanadas
Las células y los cortes fueron tratados previamente con fructosa 50 mM durante 30 minutos y con 1 mg /ml ActD 15 min antes de la administración de 100 ng /ml de TNF. Los ensayos se llevaron a cabo caspasa después de 8 horas, la liberación de LDH y citoqueratina 18 ensayos de escisión se llevaron a cabo 24 horas después del tratamiento TNF.
Ensayos de citotoxicidad
El porcentaje de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) se determinó utilizando Mono-P ensayo de LDH (Analyticon, Lichtenfels, Alemania), calculado como el cociente sobrenadante /(+ sobrenadante lisado). En cortes de tejido, la cantidad de LDH que se liberan en el sobrenadante se determinó y se normalizaron al contenido de proteína de las rebanadas individuales. actividades de caspasa se determinaron por incubación con 50 mM de sustrato
N
-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarina (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburgo, Alemania) en tampón de ensayo (HEPES 50 mM , pH 7,4, 1% de sacarosa, 0,1% de CHAPS, 10 mM DTT). La escisión del sustrato se midió cinéticamente por espectrofluorimetría. actividad caspasa se determinó como la pendiente de la regresión lineal resultante y se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia por minuto. La citoqueratina 18 de escisión se determinó en el sobrenadante de cortes de tejido utilizando el kit M30 CytoDeath ELISA (Peviva, Bromma, Suecia) según las instrucciones del fabricante.
ATP determinación
contenido de ATP se midió usando la célula CellTiter-Glo luminiscentes Viabilidad de ensayo (Promega, Mannheim, Alemania).
cuantitativo PCR en tiempo real
de alta calidad ARN total (0,5 g) fue transcrito invertir usando el kit de transcripción reversa y al azar hexámeros (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la expresión de ARNm se midió usando TaqMan 7500 o 7900HT de Applied Biosystems usando ensayos previamente desarrollados específicas para aldolasa B (Hs01554887_m1), hexoquinasa II (Hs00606086_m1) y ketohexokinase (Hs00240827_m1) frente a las curvas de calibración de vectores pCMV6-XL contienen los ADNc de los genes correspondientes (adquirido de Origene, Rockville, EE.UU.). 18S ARN (4308329, Applied Biosystems) se utilizó para la normalización.
Se realizaron estadísticas
Experimentos de acuerdo a la disponibilidad de muestras y reproducido al menos 5 veces. Todos los datos se representan como factor de cambio de control, que se establece en 1. Las barras de error indican la media ± SEM. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante una prueba t no pareada. Todas las estadísticas se calcularon utilizando el programa GraphPad Prism 4.01 (GraphPad Software Inc.) y un valor de p. & Lt; 0,05 fue considerado como significativo
Resultados y Discusión
depleción transitoria de ATP celular alcanzado en hepatocitos primarios humanos mediante el uso de concentraciones fisiológicas de fructosa
Cuando se compara con los controles no tratados, la concentración de ATP de PHH
fue encontrado para ser disminuido de una manera dependiente de la concentración
después de 30 minutos de incubación con fructosa , que presenta una reducción media de 30% de control a una concentración de 50 mM (Figura 2A, punto de datos más a la derecha; recopilación de seis donantes humanos). Cinéticamente, ATP se encontró que estaba agotado dentro de 5 min (Figura 2B) a un mínimo media de ~ 40% en comparación con controles no tratados. Este agotamiento de ATP era reversible espontáneamente como se ve por el aumento del contenido de ATP a los 120 minutos y después (Figura 2B, compilación de ocho donantes humanos). Por lo tanto, las reservas de energía celular de los hepatocitos se sometieron a una recuperación constante durante el próximo par de horas dejando una ventana depleción transitoria. Es importante destacar que, durante el agotamiento transitoria fructosa mediada por la ATP celular, no encontramos ninguna influencia sobre la viabilidad de los hepatocitos como se indica por la ausencia de cualquier aumento significativo en la liberación de LDH antes y después del inicio del tratamiento con fructosa (Figura 2C, la compilación de los datos de cuatro donantes humanos ). De nota, cualquier cultivo de PHHS fuera de nuestro tiempo de observación de 1,440 min (es decir, 24 horas) se ha demostrado que resulta en un aumento significativo de la liberación de LDH en sobrenadantes de cultivo celular (nuestros resultados no publicados) lo que indica una profunda porcentaje de PHHS desintegradas más allá el umbral de 24 horas. Por lo tanto, "a largo plazo" resultados relativos a PHH viabilidad más allá de 24 horas no son factibles en este contexto. Al mismo tiempo, nuestro mayor caracterización básica de las culturas PHH también ha demostrado que el contenido de ATP de estas células primarias disminuyen lentamente ya dentro de las primeras 24 horas de la prueba. Por lo tanto, no es posible mantener los mismos niveles de ATP (100%, medida en el inicio /inicio de estos experimentos) a lo largo de 24 horas de cultivo PHH. Sin embargo, la recuperación documentada de hasta 60% del nivel de ATP inicial y sin liberación significativa del LDH indica que el impacto de la fructosa en los niveles de ATP es altamente reversible y que los hepatocitos son capaces de hacer frente a esta disminución transitoria de ATP celular dentro de un limitado gama de tiempo de cultivo (es decir, dentro del lapso de tiempo de 24 horas).
(a-C) PHH de donantes humanos se trataron con concentraciones crecientes de fructosa (a) o se trata con una concentración fija de fructosa 50 mM (SEGUNDO); se determinó el contenido de ATP después de 30 min (A) o a diferentes puntos de tiempo, como se indica (B); Se determinó la liberación de LDH de PHH después de la incubación con fructosa 50 mM después de puntos de tiempo indicados (C). Los datos se presentan como media ± SEM.
Por lo tanto, la introducción de la protección hepática hacia TNF en la perfusión hepática aislada (PHI) parece ser factible desde el punto de vista clínico. En un estudio realizado por Cortez-Pinto
et
al
., Voluntarios sanos y pacientes con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) eran de bolo inyectado con fructosa. Posteriormente, el agotamiento de ATP se monitorizó continuamente por espectroscopía de RMN para un máximo de 60 min. Ambos voluntarios sanos, así como pacientes con EHNA se encontraron para exhibir un rápido (a 12 min después de la inyección de fructosa) y disminución transitoria de ATP celular (restauración de las reservas de ATP hepáticas su detección después de la inyección de fructosa 60 min) [13]. Por lo tanto, este trabajo de Cortez-Pinto
et
al
. jugará un papel decisivo en el control tanto de la evolución en el tiempo y el grado de agotamiento de ATP en fase futuro I /II de ensayos clínicos que se realizaron en pacientes que presentan cánceres primarios y secundarios del hígado.
también otros grupos tales observaron una rápida ozono efecto sobre ATP dentro de 30 min, cuando una dosis de peso /kg cuerpo hasta 250 mg de fructosa se aplicó en voluntarios sanos. De acuerdo con nuestros resultados experimentales, no se describieron efectos perjudiciales para el hígado (por ejemplo, con respecto a la elevación de las transaminasas) para dichos procedimientos de fructosa de carga [13] - [17]
Regulación al alza de la hexoquinasa II y abrogación de. metabolismo de la fructosa de tipo hepático en los tejidos tumorales de hígado
recientemente se muestra en líneas de células tumorales hepáticas que durante el proceso de transformación maligna una profunda regulación al alza de hexoquinasa II (HKII) se produce lo que podría explicar
que la fisiológico fenómeno de atrapamiento de ATP hepática se omite en las células tumorales
[10]. Para examinar aún más este mecanismo se utilizó muestras recién resecados de los tejidos de hígado humano, es decir, células que no están sujetas a ninguna artefactos potenciales asociados con el proceso de inmortalización. La comparación de los niveles de transcripción de HKII, ALDOB, y KHK, se encontró que el nivel medio de HKII transcripción ser aumentado 7,6 veces en los tumores de hígado humano en comparación con los tejidos del hígado humano primario no tumorales siendo normalizado al factor 1 (Tabla 1). Por el contrario, ALDOB y KHK se encontraron ser disminuido en la mayoría de los tejidos tumorales examinadas y líneas celulares de tumor (media de pliegue cambios & lt; 1 en comparación con los tejidos del hígado humano primario no tumorales se normalizaron al factor 1) (Tabla 1). De acuerdo con la hipótesis de Warburg en las alteraciones adquiridas en el metabolismo durante la progresión de los tumores malignos, también los cánceres de hígado humano puede acomodar a un entorno caracterizado por la falta de nutrientes y oxígeno a través de un equipo metabólico alterado, en particular en su no-oxidativa, es decir, la energía glicolítica metabolismo [18]. Por lo tanto, la sobreexpresión de HKII y de ese modo alterado metabolismo de la fructosa en los cánceres primarios o secundarios del hígado pueden servir como una herramienta para establecer la protección hepática selectiva en la terapia tumoral basada en TNF por medio de una administración de fructosa adyuvante.
TNF-citotoxicidad está desactivado por depleción de ATP mediada por la fructosa en PHH
a continuación, consecuencias del agotamiento de ATP hepática fueron evaluados en el nivel de citotoxicidad y la activación de caspasas en hepatocitos primarios humanos. Como marcador sustituto de la integridad de la membrana, las cantidades de la liberación de LDH después de la exposición a 100 ng de TNF /ml solo (100 ng /ml; representado como -fruc en la Figura 2A) o a un tratamiento previo fructosa combinada (15 min; + fruc en la Figura 2A ) /tratamiento con TNF (fructosa 50 mM; 100 ng /ml TNF) se determinaron en muestras de PHH derivadas del donante humanos. A lo largo de estos experimentos, la sensibilización a la muerte celular inducida por TNF se mejoró por la adición del inhibidor de la síntesis de ARN actinomicina D (ActD; 1 mg /ml), que bloquea la regulación de cualquier genes de supervivencia de protección [19]. Por examen de PHH obtenidos de especímenes de hígado humano resecados (Figura 3A), se encuentran todos los niveles de la liberación de LDH inducida por TNF significa ser atenuado notablemente en el transcurso de la fructosa-carga. De acuerdo con este hallazgo funcional, (por ejemplo, la condensación nuclear arquetípico y formación de ampollas en la membrana) fueron también encontraron cambios morfológicos siendo típica para el modo de apoptosis inducida por TNF de la muerte celular debe suprimirse sustancialmente por fructosa tratamiento previo (Figura 3B). Como se ejemplifica en PHH varios fenómenos apoptóticos como (i) la condensación de los núcleos (Figura 3B, panel superior izquierdo; Hoechst tinción), así como (ii) formación de ampollas de las membranas de células tumorales (Figura 3B, el panel inferior de la izquierda; microscopía de contraste de fase) eran claramente detectado en respuesta al tratamiento TNF solo; sin embargo, el pretratamiento con fructosa llevó unanimidad una abrogación casi completa de estos fenómenos de TNF inducida (Figura 3B, paneles superior e inferior derecha). En el trabajo anterior, ya se ha demostrado que en los hepatocitos de activación mediada por TNF de NF-kappa B se suprime en el curso de nuestro régimen de empleo concomitante de ActD o CPT, la imposición de una inhibición general de la transcripción hepática [20]. De este modo, los hepatocitos sometidos a un tratamiento combinatorio con cualquiera ActD /TNF o CPT /TNF no tienen ninguna posibilidad de expresar cantidades suficientes de las proteínas anti-apoptóticas tales como cFLIP o XIAP cuya expresión podría haber sido provocada por TNF inducida por NF-kappa B- la señalización mediada. De acuerdo con ello, los hepatocitos sometidos a depleción de fructosa-mediada de ATP en presencia de cualquiera de ActD /TNF o CPT /TNF no son capaces de contrarrestar la inhibición de la muerte de hepatocitos mediada por TNF a través de la activación de vías efectoras pro-supervivencia, tales como la activación de NF-kappa B señalización [20].
Cultured PHH de seis donantes diferentes se trataron con 400 ng ActD ml /solo o en combinación con 100 ng /ml de TNF y fructosa 50 mM como se indica. La citotoxicidad se determinó después de 24 horas de ensayo de liberación de LDH representados cambio como media veces al testigo sin tratar, que se establece en 1 (*: p & lt; 0,05, prueba t no pareada). (B) Las imágenes de PHH se tomaron 12 horas post tratamiento e ilustrar la condensación de apoptosis inducida por TNF de los núcleos en la dependencia de la fructosa-carga (+/- fruc) (panel superior: tinción Hoechst) y la formación de vesículas de membrana (panel inferior: microscopía de contraste de fase ). barra blanca indica 10 mM.
La abrogación de la muerte celular inducida por TNF bajo condiciones que agotan la ATP en tejidos de hígado humano
Con el fin de acercarse a nuestra pregunta en un entorno ambulatorio individuo más allá aislado , células cultivadas y líneas celulares, el
ex vivo
de cortes precisos con la tecnología de corte de tejido fue adaptado para nuestra situación experimental [21]. cortes de tejido de hígado humano con un diámetro de 0,8 cm y un espesor de 200 a 300 micras que consta de 10-15 capas de células, que albergan ~ 10
6 células hepáticas en promedio, se prepararon a partir tumores de hígado recién resecado y correspondiente no tejido hepático maligno, se incubaron en placas de 24 pocillos (Figura 4B). Las muestras de tejidos de hígado humano no tumorales y tejidos tumorales humanos eran de diferentes orígenes (ver tabular en la Figura 4A), incluyendo el carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma colorrectal (CRC), carcinoma pancreático (PC), y colangiocarcinoma (CC). Como control viabilidad, rodajas de precisión de corte de tejido hepático humano (A; columna izquierda) y tejido tumoral humano (A; columna derecha) fueron infectados por defecto con un gen marcador de GFP que codifica vector adenoviral (ADV-GFP, MOI 1) una hora después de corte de tejido para determinar la vitalidad de las rebanadas de tejido cultivado en placas de 24 pocillos. sólo las células viables, que presentan grandes áreas que son positivas para la expresión de genes fabricante de GFP en ambos tejidos hepáticos humanos primarios tumorales y no tumorales ofrecen la posibilidad de infección y posterior expresión de genes marcadores codificadas por el virus (nota: los cortes de tejido representar a piezas de capa multi-célula de tejidos resecados quirúrgicamente (un grosor de corte elegido de 200-300 micras calculamos unos 10-15 capas de células), por lo que técnicamente no es posible llevar todas las partes de las respectivas rebanadas en el foco (Figura 4B))
Tipos de muestras de tejidos utilizados para la generación de los datos en la Figura 4: El carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma colorrectal (CCR), carcinoma de páncreas (PC), y colangiocarcinoma (CC) (a). Como ejemplos, rebanadas de precisión de corte de tejido hepático humano (B; columna de la izquierda) y tejido humano tumor (B; columna derecha) fueron infectados con un gen marcador GFP que codifica vector adenoviral (ADV-GFP, MOI 1) una hora después de corte de tejido para determinar la vitalidad de las rebanadas de tejido cultivado en placas de 24 pocillos. Fotos fueron tomadas 24 horas después de la infección para determinar la expresión de GFP viral que sólo puede obtenerse en las regiones vitales de las muestras de tejido (filtro de 2,5 x /488 nm; barras blancas equiparan 1,000 M)
Como sustituto. marcadores de toxicidad celular, (i) la cantidad de LDH liberada de tejido por mg de proteína, (ii) una determinación basada en ELISA de citoqueratina 18 de la escisión de la correlación con la actividad de caspasa y, (iii) la actividad de escisión DEVD caspasa inducida por mg se evaluó la proteína del tejido.
los resultados obtenidos de los cortes de tejido demostraron el carácter selectivo de la protección mediada por la fructosa hacia TNF también para los tejidos del hígado y tumores de hígado primarios derivados del paciente. En rodajas de tejido de hígado humano no malignos primarios, el efecto de la hepatotoxicidad inducida por TNF en (i) la liberación de LDH (Figura 5A), (ii) citoqueratina 18-escisión (Figura 5B), y (iii) escisión de DEVD (Figura 5C) , respectivamente, disminuye de forma marcada en presencia de fructosa en casi todos los especímenes. En contraste, en cortes de tejido del tumor de hígado humano primarios, sobre un procedimiento de pretratamiento idéntica a la fructosa, en la mayoría de las muestras de pacientes se observó ninguna protección contra la citotoxicidad del TNF, si no incluso una sensibilización hacia la muerte celular inducida por TNF como se demuestra por los niveles de (i) la liberación de LDH (Figura 5D), (ii) citoqueratina 18-escisión (Figura 5E), y (iii) escisión de DEVD (Figura 5F), respectivamente. Los resultados derivados de tejido humano se adapta bien a los resultados obtenidos mediante la utilización de los hepatocitos aislados primaria murino
in vitro
y un modelo murino de lesión hepática inducida por TNF
in vivo fotos: por Latta
y
al
. [9]. TNF ejerce una apoptosis hepática y el hígado profunda daños cuantificados por DEVD de escisión, así como por LDH y la liberación ALT plasma, respectivamente. Sin embargo, la hepatotoxicidad inducida por TNF aguda y daño del hígado en los hepatocitos murinos aislados primarios y en ratones, respectivamente, fue completamente inhibida por el agotamiento de ATP con fructosa 50 mM [9].
rodajas de tejido derivadas de hígados humanos (A- C) o del hígado tejidos tumorales (D-F), respectivamente, fueron tratados con 1 mg /ml ActD en combinación con 100 ng /ml de TNF y 50 mM fructosa como se indica. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de liberación de LDH (A /C) y citoqueratina 18-división (B /D) después de 24 horas y por DEVD escisión después de ocho horas (C /F). Los datos se representan como media los cambios en el control no tratado veces, se establece en 1 (*: p & lt; 0,05, prueba t no pareada) guía empresas
En consecuencia, aquí mostramos por primera vez
Ex.
vivo, la expulsión de los artefactos de cultivo celular y epifenómenos de roedores, que la administración coadyuvante de la fructosa protege selectivamente tejidos primarios de hígado humano
ex vivo. Por el contrario, los tejidos tumorales humanos primarios derivados de las metástasis hepáticas son virtualmente no protegidos
ex vivo. Sin embargo, a nivel individual, en algunas muestras de tejido tumoral derivadas de la paciente, la fructosa-carga no protegió a los hepatocitos. Hay que tener en cuenta que las condiciones y los trastornos del hígado patológicos endógenos pueden alterar el metabolismo de la fructosa y la sensibilidad a TNF. Por otra parte, los donantes de tejidos haber recibido terapias neo-adyuvante podría dar lugar a alteraciones en la respuesta del tumor antes de la aparición putativa de cualquier régimen terapéutico a base de TNF
De forma análoga, en un conjunto de células tumorales hepáticas humanas -. HepG2 ; Hep3B; HuH7 y PCL /PRF /5 no tienen un efecto de agotamiento de ATP fue inducida por el tratamiento previo con fructosa (Figura 6A), ni ningún tipo de protección fructosa mediada hacia la apoptosis inducida por TNF podría lograrse (Figura 6B). Aunque la sensibilidad hacia TNF determinado mediante ensayo de liberación de LDH fue variable entre el tumor líneas celulares HepG2 utilizado; HepB3; HuH7 y PLC /PRF 5, se produjo ninguna mitigación de la liberación de LDH en presencia de fructosa 50 mM.
Las líneas de células tumorales hepáticas HepG2, Hep3B, Huh7 y PLC /PRF /5 fueron tratados con concentraciones crecientes de fructosa (UN). se determinó el contenido de ATP después de 30 min (A) o en diferentes puntos de tiempo como se indica. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 15). Las líneas de células tumorales hepáticas fueron tratados con 1 mg /ml ActD en combinación con 100 ng /ml de TNF y fructosa 50 mM como se indica. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de liberación de LDH después de 24 horas (n = 15) (B). Los datos se representan como media cambios en el control no tratado veces, siendo puesto a 1.
La comparación de los niveles de transcripción de enzimas glucolíticas se encontró HKII, ALDOB, y KHK, el nivel medio de HKII transcripción que aumentarse en promedio 34 veces en las líneas celulares tumorales humanas hepáticas HepG2, Hep3B, Huh7 y PLC /PRF /5 en comparación con los tejidos del hígado humano primario no tumorales que se normalizó al factor 1. en contraste, las enzimas ALDOB y KHK se encontró que eran constante o disminución en las líneas de células tumorales examinadas (media de pliegue cambios & lt; 1 en comparación con los tejidos del hígado humano primario no tumorales se normalizaron al factor 1) como se muestra en la tabla 1. el equipo enzimática de las células tumorales es altamente indicativo de la de derivación HKII eludir la ATP fregadero activo en hepatocitos primarios. En consecuencia, no agotamiento de ATP fue evidente en presencia de fructosa de hasta 50 mM. Curiosamente desde un punto de vista mecanicista, en el trabajo previo que ya se ha demostrado que los efectos de la fructosa en el agotamiento del ATP y la muerte de células tumorales inducida por TNF pueden ser "artificialmente" invertido cuando los hepatocitos murinos primarios, siendo "naturalmente" deficiente para HKII como PHH, se complementa gen con un vector que lleva el gen HKII murino [10]. En el estudio de Speicher
et
al
. se encontró que la trampa de fructosa /ATP fisiológica fue puenteado (como en las células tumorales del hígado); como resultado, el estado de protección "originalmente" realizados en hepatocitos primarios bajo carga fructosa ahora se perdió, la aplicación de una sensibilidad /toxicidad enormemente mejorada de hepatocitos primarios hacia TNF inducida por apoptosis [10].
Conclusiones
TNF constituye un fármaco antineoplásico altamente potente, que sin embargo hasta ahora no se puede aplicar a pacientes con tumores primarios y secundarios del hígado debido a su profunda hepatotoxicidad. Para superar este obstáculo, el uso combinatoria de fructosa
que puede ser usado para explotar diferencias metabólicas que constituyen una protección selectiva de los hepatocitos sanos hacia TNF
parece ser una opción terapéutica interesante. En base a los resultados que emplean exclusivamente hepatocitos primarios humanos y las rodajas de precisión de corte de los tejidos hepáticos humanos sanos
frente
tejidos hepáticos humanos malignos, parece factible que la depleción inducida por fructosa de ATP representa una forma general de proteger el hígado humano de la muerte celular dependiente de la energía no deseada inducida por TNF en el tratamiento del cáncer local basada en PHI con lo cual se mantiene la sensibilidad de los tumores hepáticos hacia terapias citotóxicas.
Reconocimientos
los autores agradecen a Christine Geisler, Igor Liebermann, Andrea Schenk e Irina Smirnow por su excelente asistencia técnica.