Extracto
Antecedentes
En este estudio pionero de la actividad biológica del compuesto organometálico de hierro -salophene (III) (Fe-SP) los efectos específicos de Fe-SP sobre la viabilidad, la morfología, la proliferación y la progresión del ciclo celular en líneas celulares de cáncer de ovario resistente al platino se investigaron.
Metodología /Principales conclusiones
Fe-SP muestra la citotoxicidad selectiva contra Skov-3 y OVCAR-3 (ovario adenocarcinoma epitelial) líneas celulares a concentraciones entre 100 nM y 1 mM, mientras que la viabilidad de las células HeLa ( epitelial adenocarcinoma de cuello uterino) o de los pulmones o la piel fibroblastos primarios no se vio afectada. Skov-3 células en contraste con los fibroblastos después del tratamiento con Fe-SP revelaron características aparentes de apoptosis incluyendo cuerpos densamente teñidos nucleares granulares dentro de núcleos fragmentados, la cromatina muy condensada y fragmentación de la cromatina. tratamiento Fe-SP llevó a la activación de marcadores de la
extrínseca vía
intrínseca
(caspasa-9) de la apoptosis
(caspasa-8) y, así como de ejecutor de la caspasa-3, mientras que PARP -1 fue desactivado. Fe-SP ejercía efectos como un agente anti-proliferativo con un IC
50 valor de 300 nM y causó progresión retardada de células a través de la fase de la fase S del ciclo celular que resulta en una detención de la fase S completa. Cuando intraperitoneal aplicado a ratas Fe-SP no mostró ninguna toxicidad sistémica en concentraciones que en los ensayos preliminares se determinaron para ser dosis pertinentes quimioterapéuticos en un modelo de células de cáncer de ovario de rata.
Conclusión /Importancia
El presente informe sugiere que el Fe-SP es un agente de supresión del crecimiento potente
in vitro Opiniones de líneas celulares derivadas de cáncer de ovario y un fármaco terapéutico potencial para el tratamiento de estos tumores
in vivo
.
Visto: Lange TS, Kim KK, RK Singh, Strongin RM, McCourt CK, Brard L (2008) de hierro (III) -Salophene: un compuesto organometálico con selectivo citotóxica y antiproliferativa Propiedades en resistente al platino Las células cáncer de ovario. PLoS ONE 3 (5): e2303. doi: 10.1371 /journal.pone.0002303
Editor: Anja-Katrin Bielinsky, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2008; Aceptado: April 11, 2008; Publicado: 28 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Lange et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la semilla Universidad de Brown y una NICHD, K12 HD043447 BIRCWH Académico subvención al Dr. Brard
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los minerales y los metales se han empleado en diversas formas de tratamiento médico durante varios miles de años. En el antiguo Egipto y Grecia, en la medicina ayurvédica, la medicina asiática, o por los metales aztecas en forma elemental, como sales o compuestos farmacéuticamente activos de las plantas se utilizaron principalmente debido a los efectos anti-inflamatorios asociados con la aplicación [1], [2 ]. Metales encontraron su reactivación en los esfuerzos farmacológicos durante el renacimiento [2], sin embargo, a menudo con efectos secundarios tóxicos debido al uso de metales pesados. El primer informe sobre el uso terapéutico de metales o compuestos metálicos que contienen no sólo como antes en condiciones ulcerosas, pero en el cáncer y la leucemia se remontan al siglo XVI [3], [4]. Varios estudios recientes han descrito las características de los diversos compuestos de metales y su uso y /o el modo putativo de acción en el tratamiento del cáncer moderna en pre-clínicos y los estudios clínicos [4], [5], [6].
El tratamiento actual de una variedad de tumores, incluyendo cáncer de ovario, se basa en compuestos de platino organometálicos. En los Estados Unidos, el cáncer de ovario epitelial (EOC) es la causa principal de muerte de tumores malignos ginecológicos y la cuarta causa más común de muerte por cáncer entre las mujeres [7]. Se estima que unos veinte y dos mil nuevos casos y se estima que quince mil muertes secundarias a cáncer de ovario se produjeron en el año 2007 [8]. Aunque la mayoría de los pacientes responden inicialmente a la cirugía citorreductora y paclitaxel adyuvante y quimioterapia basada en platino, la mayoría va a experimentar recurrencia de la enfermedad. Mientras que re-tratamiento con un fármaco a base de platino es posible que algunas mujeres la tasa de respuesta a la quimioterapia de segunda línea actual es de 15-30%, debido al aumento de la resistencia a este tipo de medicamentos que requieren el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de estos tumores [6] , [9].
El diseño de nuevos fármacos basados en metal es a menudo cuestionada por las propiedades físico-químicas tales como la solubilidad insuficiente o la inestabilidad hidrolítica por lo que es problemático para controlar su suministro, la estabilidad y en última instancia, sus efectos específicos
in vivo
. Un enfoque para controlar las respuestas citotóxicas de compuestos nuevos a base de metal es involucrar a los metales de transición biológicamente esenciales, tales como el hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), cobre (Cu), o cobalto (Co) de diferente estados de oxidación y sus intermediarios reactivos [4], [5]. El presente informe describe los efectos citotóxicos selectivos de una novela complejo organometálico (Hierro (III) -salophene; Fig. 1A). En las células de cáncer de ovario resistente al platino
(A) Síntesis del ligando salophene (SP; a partir de 1,2-fenilendiamina y o-vainillina) y del hierro (III) (Fe-SP -salophene) (ver Materiales y Métodos). (B) Caracterización estructural de Fe-SP por cristalografía de rayos X (véase la Tabla 1.)
Salophenes representan una clase de compuestos orgánicos definida por dos bases de Schiff que conectan tres restos aromáticos. Las dos mitades aromáticas exteriores general cuentan con salisaldehydes y el resto aromático central de un
o
fenileno-diamina o analógico. Salophenes muestran potente de unión con elementos de metales de transición y están estrechamente relacionados con salens que contienen bases de Schiff que se constituyen de diaminas alifáticas. Metallosalens caen en un número de compuestos de metales no de platino tales como tiosemicarbazona o hidrazona farmacóforos con actividades contra el cáncer putativo [4], [10]. Metallosalophenes no se han estudiado extensivamente con respecto a las aplicaciones en los sistemas biológicos: previamente complejos salophene-lantánidos se describieron para unirse selectivamente a los azúcares neutros y lípidos incluyendo el ácido lisofosfatídico, que sirve como un marcador para varias condiciones patológicas, incluyendo el cáncer de ovario [11] y Mn -salophene (EUK178), así como diversas características cito-protección de visualización Mn-Salens en cultivos de fibroblastos a través de peróxido de hidrógeno de barrido [12]. Un compuesto relacionado (cobalto-3,4-diarylsalen) se ha demostrado que reduce la viabilidad de varias líneas celulares de cáncer en concentraciones bastante altas (≥20 M) y se sugirió que el modo de actividad no estaba relacionado con el daño oxidativo del ADN [ ,,,0],13]. Con base en el presente informe y otros estudios sobre los efectos citotóxicos selectivos de salophenes cuando forman complejos con metales de transición, se presentó una patente. Esta invención comprende la síntesis, las evaluaciones biológicas, aplicaciones, y las composiciones farmacéuticas de metal-salophenes (MSP). Además, la invención comprende el uso de MSP como medicamentos con actividades terapéuticas anti-neoplásico, anti-angiogénico y anti-cáncer, y con otras propiedades tales como captación de radicales libres. Además, esta invención proporciona métodos que se aplicarán en la quimioprevención de la carcinogénesis química y alteraciones del metabolismo de la droga, en los epóxidos o los radicales libres de oxígeno o intermedios.
El objetivo del presente estudio fue investigar el potencial de la Fe- SP como un fármaco biológicamente activo en un modelo de células de cáncer de ovario con respecto a dependiente de la dosis efectos y específicos sobre la viabilidad, la morfología, la proliferación y la progresión del ciclo celular. Además de describir la citotoxicidad selectiva de Fe-SP en células de cáncer de ovario resistente al platino se realizó un estudio sobre la toxicidad sistémica de Fe-SP cuando se aplica en las ratas como un sistema modelo. El presente informe sugiere que este compuesto organometálico novela muestra las propiedades como un fármaco terapéutico potencial y una alternativa a los reactivos de platino en el tratamiento de cáncer de ovario.
Resultados
efecto citotóxico específico de Fe-SP en líneas celulares de cáncer de ovario resistente al platino humanos
En una primera aproximación para analizar los efectos de Hierro -salophene (III) (Fe-SP) en las células de cáncer de ovario que llevamos a cabo un ensayo de viabilidad empleando Skov-3 y OVCAR- 3 líneas (humanos resistente al platino adenocarcinoma de ovario epitelial) de células en comparación con HeLa (adenocarcinoma epitelial del cuello uterino) o pulmonar primaria (LF) o fibroblastos de la piel (BJ) (pasajes 10-13). Las células se trataron durante 24 h con diversas concentraciones (0,1 a 3 mM) de cualquiera de Fe-SP o salophene no acomplejado (SP) como un control adicional a las células no tratadas. El tratamiento con SP no afectó a la viabilidad de cualquiera de estas líneas celulares en el intervalo de 100 nM a 3 M (Fig 2) ni a concentraciones tan altas como 60 M (datos no publicados). Fe-SP, en concentraciones ≥ 3 M, ejerce efectos altamente citotóxicos en todas las líneas celulares. Sorprendentemente, la respuesta de estas células a Fe-SP no sólo era dependiente de la dosis, pero en concentraciones por debajo tipo de célula 3 M específica (Fig. 2). Mientras Fe-SP a concentraciones entre 300 nM y 1 mM demostró ser altamente citotóxico para SKOV-3 y las células OVCAR-3, el tratamiento de células HeLa o fibroblastos primarios con 1 M de Fe-SP no dio lugar a ningún cambio de la viabilidad. Por lo tanto, Fe-SP dependiendo de la línea celular tratada, muestra citotoxicidad selectiva, con una respuesta dependiente de la dosis se muestra aquí por dos líneas celulares de cáncer de ovario resistente al platino.
La citotoxicidad de Fe-SP sobre el cáncer de ovario humano células (Skov-3, OVCAR-3) se comparó con el efecto sobre células HeLa o fibroblastos primarios en pasajes 11-13 (LF1, de pulmón humano; BJ, prepucio humano). Las células se trataron durante un total de 24 h con diversas concentraciones (0,1 a 3 m) de Fe-SP o SP no complejado (Ctr). El ensayo de viabilidad MTS se llevó a cabo como se describe (Materiales y Métodos). Los experimentos se realizaron por triplicado; los datos se expresan como la media de las determinaciones por triplicado (X ± SD) de un experimento representativo en la viabilidad celular de las células no tratadas% [= 100%].
cambios morfológicos selectivos y la inducción de la apoptosis en células SKOV -3 células de cáncer de ovario después del tratamiento Fe-SP
Para analizar los cambios morfológicos de Skov-3 células de cáncer de ovario y fibroblastos primarios (BJ) tras el tratamiento Fe-SP se llevó a cabo la microscopía de luz y fluorescencia después de la fijación de la células y tinción de la cromatina nuclear con DAPI. La población de no tratado Skov-3 o células tratadas con 2 M de SP no acomplejado durante 24 h muestran una morfología homogénea con núcleos ligera y uniformemente manchados por DAPI (Fig. 3A) y apariciones ocasionales de células que se dividen en la mitosis (brillante coloración azul de los cromosomas alineados a lo largo de la placa de la metafase; no se muestra aquí). En contraste, después del tratamiento con 2 M de Fe-SP la mayoría de las células SKOV-3 de contracción que se muestra, la cromatina muy condensada, y los cuerpos nucleares granulares menudo densamente teñidos ( "cuerpos apoptóticos") dentro de núcleos fragmentados, (Fig. 3A). fibroblastos primarios tratados con Fe-SP o SP a la misma concentración no revelaron cambios importantes en la morfología ni características aparentes de apoptosis que muestra la respuesta selectiva de la línea celular de cáncer de ovario estudiados para Fe-SP.
células de cáncer de ovario (SKOV-3) o fibroblastos primarios (BJ) se trataron durante 24 h con Fe-SP o SP no complejado (Ctr.) a una concentración de 2 M antes del análisis microscópico de contraste de fase (PC) o el análisis de fluorescencia después de la tinción de la cromatina (DAPI) como se describe (Materiales y Métodos). se muestran las imágenes obtenidas de un experimento representativo. Bar = 10 micras. (B) Análisis de fragmentación del ADN en un ensayo de TUNEL. células SKOV-3 fueron tratados con Fe-SP (0, 0,7, 2 M) durante 24 h. Un ensayo de TUNEL se realizó por co-tinción con fluoresceína-12-dUTP (etiquetado de nicks de ADN en células apoptóticas) y de la cromatina con yoduro de propidio (Materiales y Métodos). Co-tinción de SKOV-3 células no tratadas antes de la fijación y permeabilización sirvió como control negativo (insertar panel superior). Durante microscopía de fluorescencia, se tomaron imágenes representativas, mancha de apoptosis (verde) y tinción nuclear (rojo) superpuestos. TUNEL núcleos positivos debido a la fragmentación del ADN aparecen como zonas amarillas. Bar = 10 mM. Análisis de transferencia (C) occidental de la activación de la caspasa. células SKOV-3 fueron tratados con Fe-SP (0, 1,25 M, 2,5 M) durante 24 h. PAGE y análisis de transferencia Western de lisados de células se llevó a cabo. Activado caspasa-3, -8, -9, y PARP-1 inactivada se visualizó mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos primarios reconocer únicamente fragmentos escindidos, no longitud completa proformas, de estas proteínas en combinación con un sistema de detección de quimioluminiscencia como se describe en (Materiales y Métodos). Se muestra un experimento representativo. Como patrón interno para la igualdad de carga (50 g /carril de proteína total celular) Las transferencias se sondearon con un anticuerpo anti-β-actina.
Un método común para detectar la fragmentación del ADN a la luz de la apoptosis celular eventos es un ensayo de TUNEL, que se empleó después del tratamiento de Skov-3 con Fe-SP. El ensayo se basa en la presencia de muescas en el ADN de apoptosis y algunas células necróticas, que puede ser identificado por transferasa terminal que catalizará la incorporación de dUTP marcado (aquí: fluoresceína). SKOV-3 células se trataron con 0,7 o 2 M Fe-SP durante 24 h. Para identificar los núcleos celulares, la contratinción con yoduro de propidio (PI), que se intercala en el ADN, se llevó a cabo. núcleos TUNEL-positivos fueron identificados por puntos amarillos resultantes de una superposición de la imagen con la tinción de apoptosis (FL-dUTP) y la tinción nuclear (Pi). Como se muestra (Fig. 3B) no hay células antes del tratamiento (panel superior), 60% de la población de células tratadas con 0,7 mM (panel central) y todas las células a 2 M Fe-SP (panel inferior) fueron células TUNEL-positivos que indican ADN fragmentado.
para definir la respuesta celular de células SKOV-3 en el tratamiento Fe-SP se analizó la activación de las caspasas característicos para la inducción de la apoptosis, así como la inactivación de PARP-1 por inmunotransferencia. El tratamiento de células SKOV-3 con 2,5 M Fe-SP durante 24 h dio lugar a una fuerte activación /escisión de caspasa-9, -8, y -3, mientras que PARP-1 fue inactivada /escindido después del tratamiento del fármaco (Fig. 3C). El tratamiento con 1,25 M de Fe-SP reveló un resultado similar, con un poco de la activación de la caspasa-9, y -3, y la inactivación de PARP-1, mientras que la activación de la caspasa-8 era tan fuerte como se observa para 2,5 M Fe-SP. Al parecer, el inicio de la activación de la caspasa y PARP-1 inactivación en células SKOV-3 de cáncer de ovario por Fe-SP resultó en las características morfológicas de apoptosis observada (Fig. 3A).
Anti-proliferativa efecto y del ciclo celular detención después del tratamiento de Skov-3 células de cáncer de ovario con Fe-SP
Tal como se describe en las secciones anteriores Fe-SP es una droga citotóxica selectiva (Fig. 2) que activa los procesos de apoptosis (Fig. 3) en SKOV -3 células de cáncer de ovario. Para investigar si Fe-SP ejerce efectos anti-proliferativos y trastornos de la progresión del ciclo celular se realizó un ensayo de incorporación de BrdU. tratamiento Fe-SP para 24 h la proliferación celular dependiente de la dosis reducida (Fig. 4) con un IC
50 valor de 300 nM. Por el contrario, no acomplejado SP no redujo SKOV-3 proliferación significativamente incluso a concentraciones de 3 mM. En la concentración de fármaco sub-citotóxica de 100 nM Fe-SP (véase la viabilidad, la figura 2) la incorporación de BrdU en el ADN se redujo en un 40% (Fig. 4).
células de cáncer ovárico (SKOV-3) se trataron con diversas concentraciones (0,1 a 10 mM) de Fe-SP o SP no acomplejado (Ctr.) durante 24 h. Un ensayo colorimétrico (basado en la incorporación de BrdU detectada por un conjugado de peroxidasa de BrdU-anticuerpo) se llevó a cabo como se describe (Materiales y Métodos). La intensidad del color a 450 nM se correlaciona directamente con la cantidad de BrdU incorporada en el ADN, que a su vez representa la proliferación. Los experimentos se realizaron por triplicado; los datos se expresan como la media de las determinaciones por triplicado (X ± SD) en% de absorbancia de las muestras por triplicado de células no tratadas [= 100%].
Además del ensayo de proliferación celular, por células El análisis del ciclo de yoduro de propidio manchada SKOV-3 células por citometría de flujo se llevó a cabo. Fe-SP, en contraste con el compuesto no complejado, reveló un aumento en el recuento de células sub-diploidal /2N (sub-G0 /G1, Fig. 5A) en un tiempo y dependiente de la dosis manera (Tabla 1) . Con respecto a las células en ciclo, Fe-SP provoca un tiempo y dependiente de la dosis detención de SKOV-3 en la fase S y, por tanto, una disminución de células en fase G0 /G1: Las células no tratadas o SKOV-3 no tratada con SP -complexed en esta población no síncrono mientras que cultivaron
in vitro ¿Cuáles son ~71-75% en G0 /G1 y ~21-24% en la fase S (Fig. 5B, Tabla 1). El tratamiento con Fe-SP a concentraciones crecientes (0,4, 0,8, 1,6 M) durante 24 o 48 h causó un aumento de células en la fase S alcanzando un máximo de 75% (1,6 M /24 h) y 87% (1,6 M /48 h ) de la población total (Fig. 5B, Tabla 1). En consecuencia, el número de células en G0 /G1 disminuye a 25% (1,6 M /24 h) y 13% (1,6 M /48 h) de la población total, mientras que a esta concentración Fe-SP no hay más células en G2 /M puede ser detectado. A una concentración de 0,8 M Fe-SP durante 24 h y 48 h un aumento de las células en G2 /M (23% /24 h; 16% /48 h) sobre el nivel base (3% /24 h, 9% /48 h) se puede observar que indica un retraso de esta fase junto con una detención en desarrollo de las células en la fase S.
células de cáncer ovárico (SKOV-3) fueron tratados con 0, 0,4, 0,8 y 1,6 M Fe-SP o SP (Ctr.) durante 24 o 48 h. Análisis del ciclo celular por FACS en base a la intercalación de propidio-yoduro en la cromatina celular se llevó a cabo como se describe (Materiales y Métodos). Los datos se presentan como (A) intensidad relativa de fluorescencia en un perfil de 2 dimensiones FACS (software ModFit LT; líneas negras = línea de datos y el ajuste del modelo de línea de toda la población, las zonas sombreadas = componentes del modelo /subpoblaciones de G0 /G1, S, G2 /M, las células apoptóticas), ejemplo que se muestra durante 48 h de tratamiento con 0,8 M compuesto, o como (B) diagrama de barras completa de todos los datos. compuerta estandarizada se utilizó para todas las muestras. Diez mil eventos fueron analizados para cada muestra.
citotoxicidad de Fe-SP en ratas como un sistema modelo
Para investigar si Fe-SP causa toxicidad sistémica
in vivo
elegimos ratas como un sistema modelo. En las dosis pertinentes preliminar quimioterapéuticos de Fe-SP en un modelo de células de cáncer de ovario animales se determinó que eran ≤1 mg /kg peso corporal (Lange et al., En preparación). En estos estudios de prueba de células de cáncer de ovario de rata (Nutu-19) fueron por vía intraperitoneal (IP) se inyectan en ratas y 3 semanas después del desarrollo de los tumores (para imitar la situación después de la cirugía citorreductora) los animales se trataron diariamente con Fe-SP a través de inyecciones IP . Duración del tratamiento duró 12 días y se basó en la carga tumoral en los animales de control. Los animales fueron controlados para cualquier malestar y el dolor por protocolos IACUC. Mientras que los animales de control mostraron una cantidad constantemente elevados de la ascitis hemorrágicas, los animales tratados Fe-SP (1 mg /mL) que aparecen volumen de ascitis hemorrágica significativamente menor, y menos el peso del tumor omental. Por otra parte, en este ensayo preliminar de tratamiento, se observó una respuesta completa en el 40% de los animales tratados (10 ratas tratadas).
En consecuencia, se llevó a cabo a 28 días los estudios de toxicidad crónica (Directrices de la OCDE para los ensayos de productos químicos (Sección-4, Nº-407)) en ratas albinas con concentraciones de Fe-SP que van desde 0,25 mg /kg a 4 mg /kg de peso corporal. Este estudio fue diseñado para investigar los efectos toxicológicos de la administración repetida de IP Fe-SP (en DMSO: agua destilada en una proporción de 01:04 en 5 días /semana durante un período de 28 días). Los animales en un grupo de dosis baja (0,25 mg /kg de peso corporal), grupo de dosis intermedia (1,0 mg /kg de peso corporal), y el grupo de dosis alta (4,0 mg /kg de peso corporal) no revelaron ningún cambio patológico en comparación con el control grupo de animales. No se observaron mortalidad o tóxicos síntomas en los grupos de prueba y control de animales, excepto la piel con volantes en el grupo de dosis alta. No se observaron diferencias significativas en el patrón de ganancia de peso /pérdida, peso de los órganos, hematológicos o parámetros bioquímicos (ver Material y Métodos) de todos los grupos de ensayo en comparación con el grupo control. Todos los parámetros estaban dentro de los límites aceptados de las variaciones normales de ratas albinas. El examen microscópico de diapositivas histopatológicos de los grupos de bajo, intermedio y alto de dosis no mostraron cambios significativos, excepto una leve degeneración de los hepatocitos en tres animales (en la dosis alta) y de células mononucleares infiltrados pulmonares en dos animales (dosis alta).
Discusión
Una baja tasa global a 5 años de supervivencia de sólo el 53% para la mujer que sufre de cáncer de ovario se relaciona con el desarrollo de la resistencia de las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos estándar, lo más notablemente análogos de platino y por lo tanto nuevos fármacos contra el cáncer deben ser desarrollados [6], [7], [8]. Para el presente informe se optó por estudiar el potencial de un nuevo complejo organometálico, hierro (III) -salophene (Fe-SP) como agente candidato para el tratamiento de cáncer de ovario. A modo de aclaración, se menciona que el término salophene, hace más de un siglo, se ha aplicado a salicilato de 4-acetamidofenilo, un analgésico y antipirético fabricado desde principios de 1900 por Bayer productos farmacéuticos (Leverkusen, Alemania) [14 ] y no está relacionado con "Salophen" descubierto como un depurador de superóxido en E. coli cuando forman complejos con manganeso (III) [15] que se asemeja el compuesto organometálico estudiado en el presente informe.
hasta la fecha ninguna investigación sobre los efectos específicos de salophenes sobre la viabilidad de las células cancerosas se han publicado. En un estudio anterior sobre los efectos citotóxicos de tiazolinas arilo bicíclicos en varias líneas celulares de cáncer humano, se determinó el rango del ensayo la viabilidad celular colorimétrico utilizado por el empleo de hierro -salophene (III) (no relacionado con tiazolinas) en 60 mM como una control negativo [16]. estudios comparativos posteriores sobre el efecto de salophenes de metales de transición (Zn (II) -, Mn (II) -, Cu (II) -, Co (III), Fe (III) -SP) y salophene no acomplejado (SP) a concentraciones más bajas reveló que debajo de una concentración de 10 mM solamente Fe (III) -SP muestra efectos citotóxicos significativos en diversas líneas celulares de cáncer (Lange et al., en preparación). Para probar el potencial citotóxico selectiva de Fe-SP en células de cáncer de ovario, se optó por dos líneas de células que son resistentes al costado con pulmonar primaria o fibroblastos de la piel líneas celulares a múltiples fármacos. OVCAR-3 células de ovario (adenocarcinoma epitelial) son resistentes a concentraciones clínicamente relevantes de adriamicina, melfalán y cisplatino. SKOV-3 células (adenocarcinoma de ovario) son resistentes a varios fármacos citotóxicos incluyendo cisplatino y adriamicina (ver ATCC, Manassas, VA; www.atcc.org). Similar a las estas dos líneas celulares de cáncer de ovario, las células de control utilizados en el presente informe, de fibroblastos primarios en los primeros pasajes y las células HeLa, poseen un alto metabolismo y tasa de crecimiento. Mostramos aquí que Fe-SP muestra citotoxicidad selectiva y dependiente de la dosis contra SKOV-3 y OVCAR-3 células a concentraciones entre 100 nM y 1 mM, mientras que la viabilidad de las células HeLa (adenocarcinoma epitelial de cerviz) o Lung-primaria o piel- fibroblastos (en pasajes 10-13) a estas concentraciones no se vio afectada. La resistencia relativa de las tres líneas celulares de control a Fe-SP apoya la idea de probar este compuesto un
in vivo
animales de ovario modelo de cáncer. salophene no acomplejado no afectó a la viabilidad de cualquiera de las líneas de células, incluso en concentraciones de hasta 60 mM, ni lo hizo 60 mM Fe (III) solo [cloruro férrico añadido] o cloruro férrico en combinación con salophene no acomplejado añadió al cultivo celular medios de comunicación [Lange et al., en preparación] que confirma indirectamente la estabilidad del complejo y, por tanto, la acción citotóxica específica en condiciones de cultivo celular.
Dado el estado actual de la investigación en el campo de los compuestos organometálicos tales como salophenes o Salens (compuestos relacionados, véase la introducción), sólo podemos especular a partir de fuentes limitadas sobre el posible mecanismo (s) de la acción citotóxica de Fe-SP. Una característica notable de salens, aún no examinadas para salophenes, es su afinidad a una variedad de moléculas neutras aromáticas tales como piridina, piridina N-óxido, isoquinolina y bencilamina [17], [18]. Salens cuando se compleja con los metales de transición actúan como nucleasas artificiales. Su reactividad en ensayos de escisión de ADN de plásmido puede ser controlado por conjugación o por el tipo y la carga del núcleo ion metálico central [18], [19], [20]. Por ejemplo, Ni (II) - o Mn (II) se encontraron -salens para inducir de manera eficiente ADN escisión de cadena, pero no Cr (II) - o Cu (II) - [18], [20] o Fe (II) -salens a menos que los grupos hidroxilo adicionales facilitan su oxidación a Cu (III) o Fe (III) de las especies [21]. Se ha postulado que Fe-Salen en cooperación con el sistema de quinina facilita la formación de hierro (III)
.O
2
- especies para producir radicales hidroxilo libres responsable de la escisión del ADN [21]. Sin embargo, la actividad de escisión de ADN de Fe (III) es más alto que -salen de Fe (II) -salen lo que sugiere que el aumento de la solubilidad en agua y la carga del Fe (III) de iones domina el potencial de escisión de la estructura [22] que probablemente se aplica a hierro -salophene (III), también. Además, los autores relacionaron la actividad de escisión de ADN por Fe (III) -salen
in vitro
a la observación de que este compuesto causó la fragmentación nuclear y la inducción de la apoptosis (a través de la liberación mitocondrial vía /citocromo c) en células HEK293 a una concentración de 50 mM [22]
.
Mientras que el mecanismo (s) de la acción de Salens o Fe-SP en células en cultivo o
in vivo
queda por investigar, morfológica selectiva cambios en las líneas celulares de cáncer y la inducción de la apoptosis después del tratamiento de drogas
in vitro ¿Cuáles son un primer indicador de potenciales efectos selectivos sobre la metástasis del tumor y la fisiología celular
in vivo
. El presente estudio muestra que Fe-SP a concentraciones de 2 mM en células SKOV-3 de cáncer de ovario, pero no en fibroblastos primarios causados fragmentación nuclear, la condensación de la cromatina, fragmentación del ADN, que son todas las características clásicas de la apoptosis [23]. transferencia Western confirmó la activación de caspasas efectoras-3 y la inactivación de PARP-1 (que participan en la reparación del ADN) [24] durante la ejecución de la apoptosis en células SKOV-3 después del tratamiento Fe-SP. Por otra parte, era evidente que el Fe-SP inducida por los dos principales vías de señalización (
intrínseca, extrínseca
) describieron la muerte celular programada [25], [26]. Hemos observado una fuerte segmentación /activación de la caspasa iniciadora-8, típico de la participación de la
extrínseca
vía de apoptosis [27], [28], en el tratamiento de Fe-SP de Skov-3 células. El
vía intrínseca media las respuestas apoptóticas a las señales de estrés, tales como las drogas, el daño en el ADN o la privación del factor de crecimiento y es iniciado por el daño mitocondrial. Es el resultado de la liberación mitocondrial de citocromo C que activa iniciador de la caspasa-9 [28], [29] y fue demostrado que contribuyen a la muerte celular de células HEK293 (línea celular de riñón humano) a Fe (III) de tratamiento -salen [22] y también en el presente estudio para Skov-3 células tras Fe (III) de tratamiento -salophene. Hasta la fecha, no se han publicado otros estudios que describen la morfología o la señalización apoptótica de las líneas de células después del tratamiento con compuestos que pertenecen a la clase de hierro-Salens o -salophenes.
Del mismo modo, no hay publicaciones que examinan el cambio en la celda la progresión del ciclo después del tratamiento, ya sea con una o salen salophene metallocomplex existe. Mientras que una publicación observó un cambio en la viabilidad y la morfología de fibroblastos de la piel en cultivo después del tratamiento con un Cr (III) -salen a altas concentraciones de 50 mM, los siguientes estudios del ciclo celular solamente se llevaron a cabo con una etilendiamina-Cr (III) - cloruro de mayor citotoxicidad [30]. Mostramos aquí que Fe-SP reduce dependientemente de la dosis la proliferación de las células SKOV-3 de cáncer de ovario (IC
50 a 300 nM). Incluso a las concentraciones sub-citotóxico (100 nM Fe-SP) la incorporación BrdU en el DNA se redujo indicando que Fe-SP ejerce efectos como anti-proliferativa y, por lo tanto, un agente potencial contra el cáncer. análisis del ciclo celular adicional de SKOV-3 después del tratamiento Fe-SP, como ya se ha indicado en el ensayo de TUNEL, reveló un aumento en la población sub-diploidal que representa células con daño en el ADN significativa, lo que indica una etapa de apoptosis tardía. Con respecto a las células en ciclo, Fe-SP en 1,6 M causó una detención completa de SKOV-3 en la fase S junto con la disminución de células en G0 /G1 y una pérdida total de células en G2 /M. Aparentemente, el tratamiento Fe-SP afectada puntos de control del ciclo celular en la fase S que causan una dosis y la reducción dependiente del tiempo de la progresión del ciclo celular. Hasta la fecha, este es el primer informe sobre la regulación del ciclo de cualquier línea celular mediante el tratamiento con cualquiera de los compuestos o metallosalen metallosalophene. Además, sólo existen pocos datos sobre el efecto de los complejos de metales de transición, en general, sobre el ciclo celular, tales como la detención de una línea celular de neuroblastoma en fase G1 cuando se tratan con una base de cobre isatina-Schiff (II) [31].
a pesar de que no es el objetivo de este informe, otros estudios podría analizar los efectos de Fe-SP en los puntos de control del ciclo celular en sincronizados Skov-3 culturas y otro tipo de cáncer y líneas de células no transformadas. Orientación de tales puntos de control se ha sugerido como un enfoque alternativo a las terapias contra el cáncer [32], [33]. Reguladores de la maquinaria del ciclo celular son frecuentemente alterado en el cáncer humano y las células transformadas pueden parecer ser más sensibles a la inhibición quinasas dependientes de ciclina (CDK) [34], [35]. Con respecto a los eventos en fase S ambos modelos de ratón y estudios sobre las células de cáncer derivadas de revelaron que la acumulación de complejos ciclina D1 /CDK4 desencadena ADN re-replicación [36] y, por lo tanto, podría ser dirigido específicamente en las células cancerosas. Como un ejemplo, Guggulsterona, un fármaco derivado de plantas, causó la detención del ciclo celular en la fase S por la supresión de ciclina D1 y cdc2 y el aumento de p21 inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina y la expresión de p27 en una amplia variedad de tipos de células tumorales humanas [ ,,,0],37]. Sobre la base de la detención específica de Skov-3 células por Fe-SP en la fase S observada en el presente estudio, en estudios futuros vamos a analizar los efectos de este compuesto organometálico novela y el cáncer potencial terapéutico de los reguladores del ciclo celular específica (CDK, ciclinas) y la replicación de inicio y -progression señales de la fase S [38], [39] en las células de cáncer de ovario resistente al platino.
para establecer el escenario para una mayor investigación de Fe-SP como un potencial