Extracto
El anticuerpo monoclonal IgM derivado del tumor PAT-SM6 mata específicamente a las células malignas mediante un mecanismo de apoptosis vinculado a la absorción excesiva de lípidos plasmáticos. El mecanismo se postula que se produzca a través de la unión de múltiples puntos de PAT-SM6 al regulador desplegada respuesta de la proteína GRP78, situado en la superficie de las células tumorales, acoplado a la unión simultánea de la lipoproteína de baja densidad de plasma (LDL). Hemos preparado y caracterizado LDL y LDL oxidado utilizando la velocidad de sedimentación y análisis de ángulo pequeño de dispersión de rayos X (SAXS). inmunoenzimático (ELISA) indican las constantes de disociación aparente de aproximadamente 20 nM para la unión de LDL o LDL oxidadas a Pat-SM6. experimentos de ELISA mostraron competición cruzada con LDL inhibición de la unión a GRP78 inmovilizado PAT-SM6, mientras que, en el experimento inverso, GRP78 inhibe la unión a LDL inmovilizada PAT-SM6. En contraste con los resultados de los experimentos de ELISA, los experimentos de velocidad de sedimentación indican interacciones relativamente débiles entre LDL y PAT-SM6, lo que sugiere inmunoabsorbancia a la placa de microtitulación es accionado por un mecanismo de unión basado en la avidez. La importancia de la avidez y la unión de múltiples puntos de antígenos de PAT-SM6 se investigó adicionalmente usando perlas de poliestireno recubiertas de antígeno. La absorción de GRP78 o LDL a microesferas de poliestireno dio lugar a un aumento en la inhibición de la PAT-SM6 la unión a placas de microtitulación recubiertas con GRP78 o LDL, respectivamente. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la acción biológica de PAT-SM6 en la apoptosis de las células tumorales depende de la naturaleza multivalente de PAT-SM6 y la capacidad de interactuar simultáneamente con LDL y múltiples moléculas GRP78 agrupados en la superficie de células tumorales.
Visto: Rosenes Z, Mok YF, Yang S, Griffin MDW, Mulhern TD, Hatters DM, et al. (2013) la unión simultánea de la Lucha contra el Cáncer de IgM anticuerpo monoclonal PAT-SM6 a lipoproteínas de baja densidad y GRP78. PLoS ONE 8 (4): e61239. doi: 10.1371 /journal.pone.0061239
Editor: Gunnar F. Kaufmann, El Instituto de Investigación Scripps y Sorrento Therapeutics, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 3 Enero, 2013; Aceptado: March 6, 2013; Publicado: 19 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Rosenes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de una beca de vinculación ARC (LP100100392) y por Patrys Ltd, una compañía actualmente la realización de ensayos clínicos de PAT-SM6 como un tratamiento potencial contra el cáncer. FH es el director gerente de Patrys, GmbH. El anticuerpo PAT-SM6 es propiedad de Patrys Limited y la empresa se compromete a hacer a libre disposición todos los materiales y la información descrita en su publicación que se solicite razonablemente con el propósito de la investigación académica, no comercial. Debido a la naturaleza propietaria de las partes de anticuerpos tendrán que entrar en un acuerdo de transferencia de material. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo es apoyado por una beca vinculación ARC (LP100100392) y por Patrys Ltd, Actualmente una empresa la realización de ensayos clínicos de PAT-SM6 como un tratamiento potencial contra el cáncer. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. FH es el director gerente de Patrys, GmbH. El anticuerpo PAT-SM6 es propiedad de Patrys Limited y la empresa se compromete a hacer a libre disposición todos los materiales y la información descrita en su publicación que se solicite razonablemente con el propósito de la investigación académica, no comercial. Debido a la naturaleza propietaria de las partes de anticuerpos tendrán que entrar en un acuerdo de transferencia de material.
Introducción
El anticuerpo humano monoclonal IgM, PAT-SM6, derivada de tejido tumoral humano [1] , es un agente anti-cáncer de potencial capaz de inducir apoptosis de células tumorales en modelos preclínicos de cáncer humano [2]. Si bien el mecanismo preciso de PAT-SM6 la muerte celular inducida no se conoce, el proceso está acompañado por la acumulación de lípidos intracelulares que conducen a la hipótesis de que PAT-SM6 facilita la absorción de los lípidos plasmáticos. De acuerdo con esta propuesta es la observación de que tanto las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y LDL oxidada interactúan con PAT-SM6 y potenciar la apoptosis inducida por PAT-SM6 [2]. PAT-SM6 también se une al regulador de respuesta de la proteína desplegada GRP78, que es sobre-expresado externamente en la superficie celular de las células tumorales [3]. GRP78, también conocido como (proteína de unión a inmunoglobulina de la cadena pesada) de BiP, es un miembro de la proteína de choque térmico 70 (HSP70) de la familia que previene la apoptosis inducida por el estrés. ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), utilizando diferentes concentraciones de recubrimiento de GRP78, han establecido anteriormente una interacción de alta avidez entre el AF-SM6 y GRP78 mediada por la unión de múltiples puntos de PAT-SM6 a GRP78 agrupado en la superficie de la bandeja de microtitulación [4]. En el presente estudio, se investigó la avidez de las interacciones de PAT-SM6 con LDL y LDL oxidada y la naturaleza competitiva de la unión de LDL y GRP78 a PAT-SM6. El papel de la multivalencia en las interacciones de PAT-SM6 con antígenos diana se investigó usando perlas de poliestireno recubiertas de antígeno. Los resultados demuestran la importancia de la agrupación de antígeno en la generación de las altas avideces que caracterizan las interacciones antígeno PAT-SM6. La capacidad de PAT-SM6 para unirse tanto GRP78 y LDL es consistente con la propuesta de que PAT-SM6 mata a las células mediante la entrega de exceso de lípidos en forma de LDL en los tumores mediante la unión al mismo tiempo para GRP78 presente en la superficie de las células tumorales [2].
Procedimientos experimentales
Materiales
El anticuerpo monoclonal humano se expresaron PAT-SM6 y purificar a partir de cultivos en suspensión estable de una línea celular humana en medio libre de suero [5], [6]. control de isotipo IgM se obtuvo de Jackson ImmunoResearch Labs, Inc, West Grove, PA. PAT-SM6 se marcó con fluoresceína usando isotiocianato de fluoresceína (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GRP78 humano maduro que contiene un C-terminal de 6 × Su etiqueta se expresó y se purificó a partir de
E. coli
como se describe anteriormente [4].
Declaración de Ética
Fresh muestras de sangre humana se obtuvieron del Hospital de San Vicente, Melbourne utilizando los protocolos aprobados por el Comité de Ética del Hospital de San Vicente Melbourne Investigación Humana . Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes por el trabajo humano original que produjo las muestras de sangre para el aislamiento de las LDL. LDL se aisló por fraccionamiento densidad ultracentrifugación preparativa usando KBr [7]. La LDL oxidada se preparó por la adición de 20 mM CuSO
4-200 g /ml de LDL y la incubación a temperatura ambiente durante 16 horas [8]. La oxidación se monitorizó midiendo la absorbancia a 234 nm y por tioflavina fluorescencia T (ThT). ThT fue añadido a LDL a una concentración final de 8 M y se midió la fluorescencia utilizando un
f
max
lector de placas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) equipado con filtros de 444/485 nm de excitación /emisión. La oxidación se detuvo mediante la adición de EDTA a una concentración final de 1 mM. LDL y LDL oxidada se dializaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) que contiene EDTA 1 mM y 0,1% NaN
3 y se almacena a 4 ° C. La concentración de proteína de LDL se determinó a partir de la absorbancia a 280 nm corregida para la dispersión de luz [9] y utilizando un coeficiente de extinción de 844 cm
estimada a partir de la composición de aminoácidos de la apolipoproteína B. La concentración de 2 /g molar de LDL se calculado asumiendo un valor de 2,2 × 10
6 para el peso molecular promedio de LDL humana [10].
ángulo pequeño dispersión de rayos X (SAXS)
Sincrotrón SAXS con inline cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-SAXS) de LDL y LDL oxidada se realizó a la línea de luz australiano Sincrotrón SAXS /WAXS. Las muestras fueron sometidas a la SEC en una columna con un tamaño de poro de 500 Å (WTC-050N5, Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA), dando un rango de separación de proteínas MW efectivo de 15.000 a 5.000.000 Da. La columna se equilibró en tampón que contenía PBS a una velocidad de flujo de 0,4 mL /min. Las inyecciones fueron 20 l con una concentración de proteína de 3 mg /ml. El tamaño del haz en la muestra fue de 250 micras x 150 micras horizontal vertical (FWHM). Detector de imágenes Pilatus 1M se analizaron como promedios de diez secuenciales 2 s exposiciones individuales y se convierten a
I
(
q
) SAXS perfiles utilizando el software de Scatterbrain (Sincrotrón de Australia).
I
(
q
) es la intensidad de rayos X dispersos como una función de la magnitud del vector de transferencia de momento
q
= (4πsinθ) /λ, donde el ángulo de dispersión es 2θ y la longitud de onda de rayos X es λ (1,12713 Å). Los datos se recogieron a 298 K usando una longitud de cámara de 3,3 m, lo que autoriza las intensidades que deben recogerse en un
q-
gama de 0,00429 a 0,24575 Å
-1. perfiles de SAXS se analizaron mediante el ATSAS (versión 2.4) conjunto de programas [11].
Sedimentación análisis de la velocidad
sedimentación experimentos de velocidad utilizando la óptica de absorbancia se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica XL-I (Beckman Coulter, Fullerton, CA) equipado con un rotor Ti An-60 a 20 ° C. Las muestras de proteína se añadieron a centros de mesa EPON llenas de doble sector con PBS en el compartimiento de referencia. datos de absorbancia radiales fueron adquiridas a una velocidad del rotor de 28.000 rpm, utilizando una longitud de onda de 280 nm, y con incrementos radiales de 0.003 cm en modo de escaneo continuo. experimentos velocidad de sedimentación también se realizaron usando un XL-A ultracentrífuga analítica equipado con un sistema de detección de fluorescencia (FDS; Aviv Biomedical) para controlar la sedimentación de marcado con fluoresceína PAT-SM6 y KBPA-101. Los límites de sedimentación se ajustaron a un modelo suponiendo una distribución de coeficientes de sedimentación para las especies que no interactúan, c (S), utilizando el programa SEDFIT [12]. Los datos se ajustaron utilizando máxima entropía regularización, un valor de p de 0,95 y una relación de fricción de 1,9 [4]. coeficientes de sedimentación se corrigieron para los efectos de la LDL en densidad de la solución y la viscosidad, asumiendo valores de 0,967 ml /g y 3,4 ml /g para el volumen específico parcial y la viscosidad intrínseca de LDL, respectivamente [10].
Enzyme Vinculado inmunoabsorbente (ELISA)
Los antígenos se revistieron sobre bandejas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorp) por incubación durante la noche a 4 ° C. Después, las placas se lavaron 3 veces en PBS, 3 veces en PBS + 0,1% Tween 20, 3 veces en PBS y se bloquearon con 5% (w /v) de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, después se lavaron de nuevo como anteriormente. Todas las preparaciones de anticuerpos se realizaron en 5% (w /v) de BSA en PBS. Para los experimentos de ELISA indirectos, los anticuerpos se aplicaron directamente a la placa y se incubaron durante 1 hora. Para los ELISA competitivos, los anticuerpos se incubaron en solución con diversas cantidades de antígeno antes de la aplicación a la placa de microtitulación. Después de lavar de nuevo como anteriormente, peroxidasa conjugado de conejo anti-IgM humana anticuerpo secundario (Dako) se aplicó a la placa y se incubó durante 1 hora según las instrucciones del fabricante. Después de un lavado final, la unión del anticuerpo se determinó usando 100 l por pocillo de 3,3 ', 5,5'-solución de sustrato de tetrametilbenzidina (Sigma) y midiendo el cambio de color a 655 nm. El curso de tiempo para el desarrollo de color fue esencialmente lineal en el rango de densidad óptica 0-3. Las mediciones se realizaron 15 min después de la adición de sustrato. En experimentos de control, que implica el recubrimiento directo de las placas con PAT-SM6, del intervalo de concentración /ml, se observó 0-2,5 g un aumento sistemático en la señal de ELISA con el aumento de concentración de recubrimiento, lo que implica una correlación directa entre la señal y el ELISA cantidad de anticuerpo unido a la placa. Se analizó los datos de ELISA para la titulación de anticuerpo primario de unión a LDL inmovilizada suponiendo un simple isoterma de unión de Langmuir se describe por la relación Y = K
a /(1-K
a) en la que Y es la magnitud de la señal de ELISA y K
a es la constante de unión aparente, asumiendo una sola clase de sitios de unión.
antígeno de recubrimiento de poliestireno microesferas
las suspensiones de 1 micra de diámetro microesferas de poliestireno (Polysciences, Inc) a una concentración de 2,5% se lavaron por granulación repetida (× 3) en una microcentrífuga y la resuspensión en PBS (v w /), PBS-0,1% de Tween 20, y luego una última vez con PBS. Las microesferas lavadas se sedimentaron y se resuspendieron en 2 mg /ml de antígeno (LDL o GRP78) o 5% (w /v) BSA (solución de bloqueo) a una concentración final de microesferas de 2,5% (w /v). Los tubos de mezcla de microesferas /antígeno se incubaron durante la noche en una plataforma giratoria a 4 ° C. Para determinar el grado de unión del antígeno, las microesferas se sedimentaron, y la absorbancia en el sobrenadante midieron a 280 nm y en comparación con la absorbancia de la solución de antígeno inicial. A continuación, las microesferas revestidas se lavaron como anteriormente y después se bloquearon con 5% BSA y se almacenó a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
Resultados
La oxidación de LDL
El Cu
2 + inducida por la oxidación de LDL se controló midiendo la absorbancia de la luz a 234 nm (Figura 1A). El aumento en la absorbancia a 234 nm se aproxima a un máximo después de 24 horas y es atribuible a la formación de dienos conjugados [13]. la oxidación de LDL también se monitorizó mediante un ensayo ThT continua [8]. Los resultados muestran que ThT fluorescencia de LDL incubado con CuSO mM 20
4 aumenta durante el mismo período de tiempo alcanzando una meseta después de 16 horas sin cambios correspondientes observados para las incubaciones de control de LDL o ThT solo. Además de la caracterización de la LDL oxidada se llevó a cabo utilizando el análisis de la velocidad de sedimentación. distribuciones coeficiente de sedimentación (Figura 1C) mostraron un único pico simétrico de LDL con un coeficiente de sedimentación modal de aproximadamente 4,5 S, mientras que la distribución obtenida de las LDL oxidadas fue bimodal con el pico principal sedimentación con un coeficiente de sedimentación modal de aproximadamente 8 S. Este aumento de la velocidad de sedimentación es atribuible a un cambio en la densidad de las partículas debido a una pérdida significativa de lípidos después de la oxidación [8].
(a) cambio en la absorbancia a 234 nm como una función del tiempo de incubación. (B) Evolución temporal para el cambio en la fluorescencia de ThT LDL (línea continua), LDL incubado con 20 mM CuSO
4 (línea discontinua) o PBS solo (línea de puntos). (C) La sedimentación coeficiente de distribución obtenido a partir de análisis de la velocidad de sedimentación de las LDL (línea discontinua) y LDL oxidada (línea continua).
de ángulo pequeño dispersión de rayos X (SAXS) Análisis de LDL y LDL oxidada
análisis de SAXS se ha utilizado ampliamente para caracterizar LDL y Cu
2 + tratada con LDL oxidada [14], [15], [16]. Esta técnica proporciona información sobre el tamaño y forma de las partículas de lipoproteínas de parámetros tales como el radio de giro (
R
g) y la dimensión máxima (
D
max), así como información sobre la estructura interna de las partículas de la función de distribución par distancia
P
(
r
). Aquí, LDL y LDL oxidada se sometieron a SAXS cromatografía de exclusión por tamaño de sincrotrón (SEC-SAXS) [4]. Este método mejora la calidad de los datos de SAXS mediante la entrega del tamaño fraccionado la muestra directamente en el haz, y por lo tanto la separación de la dispersión de la partícula de interés de la de cualquier agregado, pero que también proporciona una cerca de partido tampón perfecto para la resta en la reducción de datos proceso.
la elución de LDL y LDL oxidada de la columna se monitorizó mediante absorbancia a 280 nm y la intensidad SAXS en cero-ángulo (
I
(0)) como una función del volumen. Los perfiles de SAXS de la especie de los picos se muestran en la Figura 2A. Para cada especie,
R
g se calcula a partir de la pendiente de sus respectivas parcelas Guinier (ln [
I gratis (
q
)] frente a
q
2) (Figura 2B). Para la trama LDL Guinier fue lineal en un
q
.
R
g rango de 0,8 a 2,4, dando un
R
valor de 134 g ± 1 Å. El
R
g de las especies de pico de LDL medidos aquí está en buen acuerdo con el valor medio publicada de 139 Å de la gama de 121-160 Å observó durante 17 preparaciones de LDL de 12 donantes [16]. Para las LDL oxidadas la trama Guinier fue lineal en un
q
.
R
g rango de 0,8-1,6 dando un
R
valor de 112 g ± 3 Å. Rayos X y dispersión de neutrones estudios previos de la oxidación de LDL empleadas muestras estáticas, que mostraron que depende del tiempo y [Cu
2 +] - aumentos dependientes en aparente
R
g, hasta ~ 160 Å, debido a la formación de agregados [16], [17]. La SEC-SAXS deriva
R
valor de g se informó aquí es la primera medición de partículas de LDL oxidadas aislados en la ausencia de agregados. Para cada perfil SAXS el
P gratis (
r
) se estimó la función de Fourier transformar indirecta (Figura 2C). El análisis de
P gratis (
r
) indica que el LDL y LDL oxidada tenido similares
D
max valores de ~ 250 Å, lo que es consistente con las mediciones anteriores [ ,,,0],dieciséis]. El análisis de
R
valor g de LDL de
P gratis (
r
) fue de 131 ± 2 Å y de las LDL oxidadas fue de 109 ± 3 A, que son en buen acuerdo con los valores de la Guinier análisis. Cu
2 + mediada por la oxidación provoca cambios característicos en la organización interna de la partícula de LDL, con se ha atribuido a una pérdida de ésteres de colesterol y la estructura ordenada triacilgliceroles [16].
P gratis (
r
) análisis es diagnóstica de este cambio, ya que la curva
P gratis (
r
) de LDL exhibe un fuerte pico negativo en
r
= 135 a, que se pierde por completo tras la oxidación (Figura 2C). Se ha propuesto que este pico negativo se debe a contraste negativo de las cadenas de hidrocarburos ordenados en la monocapa externa de LDL, que tienen la densidad de electrones inferior a la del disolvente circundante. La oxidación se cree que resulta en la adición de oxígeno a las cadenas de acilo insaturados, haciéndolos más electrón denso que el agua y resulta en contraste positivo [16], [17].
A. Los datos de SAXS se muestran como media intensidad
I
(
q
) ± 1 desviación estándar, como una función de transferencia de impulso
q Opiniones de LDL (círculos sólidos) y oxidados LDL (círculos abiertos). parcelas (B) Guinier de los datos de SAXS a baja
q Opiniones de LDL (círculos rellenos) y LDL oxidada (círculos abiertos). La inferior y superior
q
.
R
G de los límites Guinier los análisis se indican. función (C) Distribución de distancia Par
P gratis (
r
) como función de la distancia radial
r Opiniones de LDL (círculos cerrados) y LDL oxidada (círculos abiertos).
inmunoabsorción ligado a enzimas Los ensayos de PAT-SM6 Interacciones con LDL y LDL oxidada
experimentos de ELISA se realizaron con un intervalo de concentraciones y placas PAT-SM6 recubierto con diferentes concentraciones de cualquiera de LDL o LDL oxidadas (Figura 3). Los resultados muestran un aumento sistemático en la señal de ELISA como una función de la concentración de PAT-SM6 con más extensa unión observada a concentraciones de recubrimiento de antígeno más altos. Los datos se ajustaron a una simple isoterma de unión de Langmuir para obtener las aparentes constantes de unión (K
a) como una función de la concentración de recubrimiento de LDL (Figura 3C). Los resultados muestran que la interacción de PAT-SM6 con LDL o LDL oxidada es similar y relativamente independiente de las concentraciones de pintura, haciendo aparente K
a valores de aproximadamente 50 M
-1, correspondientes a constantes de disociación de 20 nM. Estos valores indican que la interacción entre PAT-SM6 y LDL es más débil que la interacción entre PAT-SM6 y GRP78, donde los estudios de ELISA produjeron constantes de disociación aparente de aproximadamente 4 nM [4].
Los ensayos se realizaron usando ( a) LDL o (B) la LDL oxidada en concentraciones de recubrimiento de 0 mg /ml (círculos abiertos), 1 mg /ml (triángulos cerrados), 2 mg /ml (rombos abiertos), 3 mg /ml (cuadrados cerrados), 4 mg /ml (triángulos invertidos en), y 5 mg /ml (círculos cerrados). (C) Los datos se ajustaron a una simple isoterma de unión para obtener las constantes de unión aparente (K
a) para PAT-SM6 de unión como una función de la concentración de recubrimiento de LDL (círculos abiertos) o LDL oxidada (círculos cerrados). Las barras de error representan los intervalos de confianza del 95% de la instalación de los datos de ELISA a una curva de unión de Langmuir.
La unión simultánea de LDL y GRP78 a PAT-SM6
La capacidad de PAT-SM6 para interactuar simultáneamente con GRP78 y LDL se examinó mediante ELISA de competencia experimentos. Los resultados se realizaron con concentraciones bajas de galvanoplastia de GRP78 o LDL para permitir una inhibición más eficiente de PAT-SM6 de unión mediante la adición de antígeno soluble. Resultados utilizando LDL soluble como competidor indicó que una inhibición significativa de PAT-SM6 se observó unión para placas revestidas con cualquiera de GRP78 o LDL. Por el contrario, los resultados utilizando GRP78 como un competidor revelaron una inhibición significativa de PAT-SM6 unión a GRP78 o LDL inmovilizada, lo que confirma la capacidad de GRP78 y LDL a competir entre sí para la unión a PAT-SM6. Una observación adicional de la Figura 4 es que se requieren concentraciones más altas de LDL por medio de la inhibición máxima, en comparación con GRP78, en consonancia con la mayor afinidad de GRP78 para PAT-SM6 reveló a partir de experimentos de ELISA directos (Figura 3 y [4]).
Wells se recubrieron con 7,5 mg /ml GRP78 (círculos), 7,5 mg /ml de LDL (triángulos) o se dejaron sin revestir (cuadrados). se incubó PAT-SM6 (5 mg /ml) con diversas concentraciones de competidor antes de la aplicación a la placa de microtitulación.
análisis de sedimentación de velocidad de PAT-SM6 y LDL
Los resultados en la Figura 3 mostró que la aparente K
a los valores para la interacción de PAT-SM6 con LDL inmovilizada o LDL oxidada fue independiente de la concentración de recubrimiento del antígeno. Estos resultados están en contraste con los resultados obtenidos con GRP78 [4], donde la fuerte dependencia de PAT-SM6 vinculante sobre la concentración de recubrimiento de GRP78 fue tomada como evidencia para el agrupamiento de antígenos como un factor determinante de la fuerza de las interacciones de unión PAT-SM6. Los resultados observados para LDL LDL sugirieron que puede ser agrupado en la placa de microtitulación, incluso a bajas concentraciones de chapado, o que PAT-SM6 puede unirse directamente a las partículas de LDL individuales. Para examinar esta última posibilidad, experimentos la velocidad de sedimentación se llevaron a cabo para caracterizar la interacción entre LDL soluble y PAT-SM6. Los resultados de la Figura 5A muestran distribuciones coeficiente de sedimentación de una mezcla de LDL y PAT-SM6. Dos picos principales se observaron con coeficientes de sedimentación modales cerca de los valores observados para LDL solo y PAT-SM6 solo. Análisis del coeficiente de sedimentación promedio del pico más rápido, corrigiendo para el pequeño efecto de LDL en densidad de la solución y la viscosidad, no reveló diferencias significativas en comparación con el coeficiente medio de sedimentación para PAT-SM6 solo. La ausencia de cualquier cambio detectable en la tasa de sedimentación de PAT-SM6 en presencia de LDL indica muy poca interacción entre estas especies en estas condiciones y está en desacuerdo con las fuertes interacciones observadas en los experimentos de ELISA (Figuras 3 y 4). Una posibilidad considerada fue que el uso de 50 mg /ml de BSA como agente de bloqueo en los experimentos de ELISA puede actuar como un agente de aglomeración macromolecular y aumentar la afinidad de unión [18]. Para probar esta posibilidad sedimentación experimentos de velocidad se realizaron utilizando la etiqueta fluorescente PAT-SM6 y el sistema de detección de fluorescencia en la ultracentrífuga analítica. Esto permitió que la tasa de sedimentación de la etiqueta PAT-SM6 a monitorizarse en presencia y en ausencia de altas concentraciones de BSA. Los resultados de la Figura 5 muestran que LDL tiene muy poco efecto sobre la velocidad de sedimentación de la etiqueta fluorescente PAT-SM6 ya sea en presencia o ausencia de 50 mg /ml de BSA. Los resultados de velocidad de sedimentación de la Figura 5 no incluyen una interacción de alta afinidad entre LDL soluble y sitios individuales en PAT-SM6 y apoyan la propuesta de que la unión de PAT-SM6 a LDL inmovilizado en placas de microtitulación es accionado por un mecanismo de unión basado en avidez de lo contrario interacciones débiles (al menos gama alta M).
(a) sedimentación distribuciones de los coeficientes obtenidos mediante la óptica de absorción a 280 nm para PAT-SM6 (0,3 M, negro), LDL (1,8 M, rojo) y una mezcla de PAT-SM6 y LDL (0,3 M y 1,8 M, respectivamente (verde). (distribuciones B) coeficiente de sedimentación obtenidas utilizando la óptica de fluorescencia para marcado con FITC PAT-SM6 (40 nM) en presencia (línea continua) y ausencia (rotos line) de LDL (1,8 M). (distribuciones C) sedimentación coeficiente obtenido en presencia de BSA (50 mg /ml) usando óptica de fluorescencia para marcado con FITC PAT-SM6 (40 nM) en presencia (línea continua) y ausencia (línea discontinua) de las LDL (1,8 M).
las interacciones de PAT-SM6 con recubierta con antígeno de poliestireno microesferas
la evidencia del PAT-SM6 interactúa con múltiples puntos de fijación a los antígenos agrupados sugieren que la absorción de GRP78 o LDL a microesferas de poliestireno pueden aumentar la capacidad de estos antígenos para inhibir interacciones de unión PAT-SM6. microperlas de poliestireno recubiertas de antígeno se prepararon por incubación de microperlas de poliestireno con antígenos y el control de la extensión de la unión usando un ensayo de centrífuga de la granulación. Los resultados de la Figura 6 muestran que GRP78 y LDL se unen rápidamente a las perlas de poliestireno. Los resultados también muestran el grado de unión de los aumentos de GRP78 como una función de la concentración de GRP78 y que BSA se une a las perlas de una manera saturable (Figura 6).
(A) La cantidad de proteína unida por gramo de microesferas como una función de GRP78 (círculos cerrados) o la concentración de BSA (círculos abiertos). (B) timecourse de GRP78 (círculos sólidos) y LDL (triángulos abiertos) que se une a microesferas de poliestireno.
experimentos de ELISA para probar si GRP78 o microperlas recubierto de LDL inhibir la unión de PAT-SM6 a antígeno placas de microtitulación recubiertas se realizaron con altas concentraciones de antígeno de recubrimiento para maximizar el alcance de la agrupación en el plato. Los resultados de la Figura 7 muestran que las microesferas recubiertas GRP78 inhiben PAT-SM6 la unión a placas de microtitulación recubiertas con cualquiera de GRP78 mientras que, durante el mismo intervalo de concentraciones y condiciones, GRP78 soluble o microesferas de control recubiertos con BSA no inhibió. Estos resultados indican una fuerte unión de PAT-SM6 a perlas recubiertas de GRP78 adjunto de multivalente que secuestra PAT-SM6 y previene la unión de PAT-SM6 a placas de microtitulación recubiertas GRP78. Se obtuvieron resultados similares usando placas de microtitulación de LDL-revestido, aunque en este caso las dos perlas de GRP78 y GRP78 recubierto soluble inhibieron PAT-SM6 la unión a las placas. Este resultado es coherente con la aparente más elevada avidez de PAT-SM6 para GRP78 en comparación con LDL. Los resultados de la Figura 8 muestran que microesferas recubiertas de LDL inhiben PAT-SM6 la unión a placas de microtitulación revestidas con LDL, mientras que bajo la misma gama y las condiciones de LDL soluble o microesferas de control recubiertos con BSA no inhibió la concentración. Los resultados de la Figura 8 también muestran las microesferas de LDL-revestido no inhiben la unión de PAT-SM6 a placas recubiertas GRP78, en consonancia con una mayor avidez de PAT-SM6 para GRP78 agrupado en comparación con LDL agrupado.
PAT -SM6 (5 mg /ml) se incubó con microesferas recubiertas de GRP78 (círculos), solubles GRP78 (triángulos) o microesferas recubiertas BSA (cuadrados) antes de la adición a las placas de microtitulación.
PAT- se incubó SM6 (5 mg /ml) con microesferas de LDL-revestido (círculos), LDL soluble (triángulos) o microesferas recubiertas BSA (cuadrados) antes de la adición a las placas de microtitulación.
Discusión
los anticuerpos IgM naturales forman parte de la respuesta inmune innata en los que están implicados en el reconocimiento de partículas extrañas, tales como oxidadas y proteínas y células transformadas [19] modificado químicamente. Esta clase de anticuerpo muestran típicamente baja especificidad de antígeno con la capacidad de unirse más de un tipo de antígeno [20]. Esta capacidad de unirse a más de un tipo de antígeno es evidente en el caso de PAT-SM6 donde los datos de ELISA indica interacciones fuertes con la célula GRP78 asociada a la membrana estructuralmente no relacionados en las células tumorales [3] y con los dos lipoproteínas nativas y oxidadas de baja densidad de plasma [2]. Estudios previos muestran que la interacción de PAT-SM6 con GRP78 está mediada a través de un mecanismo basado en la avidez basado en la multivalencia del anticuerpo. Los resultados presentados en el presente estudio sugieren un mecanismo basado en la avidez similares opera para la unión de PAT-SM6 con LDL. Varias observaciones apoyan esta conclusión. La interacción de PAT-SM6 con LDL analizado por velocidad de sedimentación reveló ningún cambio significativo en la tasa de sedimentación de PAT-SM6 en presencia de LDL. En contraste, se observaron fuertes interacciones entre inmovilizada GRP78 y PAT-SM6 en los experimentos de ELISA. Estos estudios sugieren interacciones relativamente débiles (en el rango de concentración micromolar) cuando PAT-SM6 y LDL están libres en solución, pero las interacciones mucho más fuertes con LDL agrupado en la placa de microtitulación. El apoyo a la función de agrupamiento también es proporcionada por los resultados de los experimentos que emplean microesferas de poliestireno recubiertas de antígeno, que mostraron una mayor inhibición de la unión de PAT-SM6 a placas de microtitulación recubiertas con antígeno, en comparación con concentraciones equivalentes de formas solubles del antígeno. A diferencia marcada con interacciones PAT-SM6 con LDL en comparación con las interacciones con GRP78 es que la avidez aparente para las interacciones PAT-SM6 con LDL no reveló una dependencia de la concentración de recubrimiento de LDL. En el caso de GRP78 la avidez aparente para PAT-SM6 aumenta con la concentración de recubrimiento, consistente con un efecto de agrupamiento de antígenos [4]. Una posible explicación para esta diferencia es el gran tamaño de LDL y más fuerte la unión a la placa de microtitulación que conduce a la agrupación, incluso a bajas concentraciones de recubrimiento
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Análisis de la unión de PAT-SM6 a LDL y LDL oxidada indicado similares avidez aparentes (K
d de aproximadamente 20 nM) y en general más débil unión compararon con la interacción con GRP78. Los estudios previos de la interacción de PAT-SM6 con LDL y LDL oxidada, realizan con un único recubrimiento de antígeno y la concentración PAT-SM6 produjeron una señal de ELISA inferior (65%) para la unión a LDL en comparación con LDL oxidada [2] en contraste con los resultados presentados en la Figura 3, donde las curvas de unión para PAT-SM6 a LDL y LDL oxidada fueron muy similares. Las posibles explicaciones para esta discrepancia son las variaciones en los métodos utilizados para la preparación de las LDL oxidadas.