Extracto
Nuestro estudio piloto utilizando matrices miARN encontró que los genes miARN-29c (MIR -29˚C) se expresa diferencialmente en el cáncer de pulmón de células línea 95C bajo metastásico emparejado en comparación con la línea celular de cáncer de pulmón metastásico alta 95D. Bioinformática análisis muestra que la integrina β1 y metaloproteinasas de matriz 2 (MMP-2) podría ser importantes genes diana de miR-29c. Por lo tanto, la hipótesis de que el miR-29c suprime la adhesión de células de cáncer de pulmón a la matriz extracelular (ECM) y la metástasis por la orientación de la integrina β1 y MMP2. Los estudios con ganancia de función que aumentaron la expresión de miR-29c 95d en las células mediante el uso de sus imitadores mostraron reducciones en la proliferación celular, la adhesión a ECM, la invasión y la migración. En contraste, los estudios de la pérdida de la función que redujeron el miR-29c mediante el uso de su inhibidor de 95C células promueven la proliferación, adhesión a ECM, la invasión y la migración. Además, el ensayo de indicador de luciferasa de doble demostró que miR-29c inhibe la expresión del gen de luciferasa que contiene el extremo 3 'UTRs de integrina β1 y mRNA MMP2. transferencia de Western indicó que miR-29c downregulated la expresión de la integrina β1 y MMP2 a nivel de proteínas. análisis de zimografía de gelatina confirmó, además, que el miR-29c disminución de la actividad de la enzima MMP-2. ratones desnudos con modelos de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células confirmó que el miR-29c inhibe la metástasis del cáncer de pulmón in vivo, incluyendo el hueso y las metástasis de hígado. En conjunto, nuestros resultados demuestran que miR-29c sirve como un supresor de la metástasis tumoral, que suprime la adhesión de células de cáncer de pulmón de ECM y la metástasis inhibiendo directamente la β1 integrina y la expresión de MMP2 y reduciendo aún más la actividad de la enzima MMP2. Los resultados muestran que miR-29c puede ser una nueva diana candidato terapéutico para retardar la metástasis del cáncer de pulmón
Visto:. Wang H, Zhu Y, Zhao M, Wu C, Zhang P, Tang L, et al. (2013) miARN-29c Suprime el cáncer de pulmón de la adhesión celular a la matriz extracelular y la metástasis por la orientación de integrina β1 y Matrix Metalloproteinase2 (MMP-2). PLoS ONE 8 (8): e70192. doi: 10.1371 /journal.pone.0070192
Editor: Edward F. Arado, Instituto de Investigación Lerner, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 8, 2013; Aceptado: 17 Junio 2013; Publicado: 6 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30800631, Nº 30872553 y Nº 81272433) y una subvención de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghai (Nº 09411964800). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hoy en día, el cáncer de pulmón es uno de los cánceres más comunes. Más de 90% de los pacientes con cáncer de pulmón mueren de metástasis en lugar de a partir de sus tumores primarios, lo que sugiere que la metástasis es un factor pronóstico tecla [1], [2]. La progresión tumoral y la metástasis es un proceso complejo que involucra muchos jugadores diferentes biológicos. Uno de los reguladores críticos que participan en este proceso es un microARN (miARN) [3].
miRNAs maduros son cortos, de cadena sencilla, endógeno y ARN no codificante que consta de aproximadamente 22 nucleótidos, que regulan los genes a nivel post-transcripcional durante el proceso de traducción. Ellos pueden dirigirse a la 3'-UTR (regiones no traducidas) de ARNm, que funcionalmente conduce a una inhibición de la traducción o la desregulación del objetivo mRNA [4]. miRNAs tienen una influencia importante en diversos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, la apoptosis, la resistencia al estrés, metabolismo de las grasas, y el desarrollo. Por lo tanto, juegan un papel crucial en diferentes enfermedades incluyendo el cáncer [3]. Por otra parte las investigaciones indican que algunos miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales. MiRNAs juegan un papel importante en la tumorigénesis y progresión tumoral, incluyendo la proliferación y la metástasis [3], [5] - [8]. Por ejemplo, el miR-10b promueve la metástasis de tumores de mama, mientras que el miR-335 y miR-126 suprime la metástasis [9], [10]. Por lo tanto, la próxima generación de dianas terapéuticas para los tumores malignos puede ser miRNAs [11].
La familia de miR-29 es una familia conservada de miRNAs incluyendo miR-29a, 29b-MIR, MIR-29c, y miR -29d. Recientemente, se encontró que los niveles de expresión de muchos miembros de la familia miR-29 se reduzca en una variedad de cánceres. Por ejemplo, Sengupta y sus colegas han demostrado que el miR-29c es el regulado en los carcinomas nasofaríngeos [12], mientras que Fabbri y sus colegas descubrieron que la familia miR-29, incluyendo el miR-29c, se dirige a DNMT3A y DNMT3B en tejidos de cáncer de pulmón y las células [13].
en el presente estudio, nuestro estudio piloto anterior encontró una expresión diferencial casi cuatro veces de miR-29c entre alta (95D) y bajo metastásico (95C) líneas celulares de cáncer (detalles en Tabla S1). Varios estudios han tomado ventaja de esta diferencia entre las líneas de células individuales en relación con la invasión y la metástasis [14], [15]. Sin embargo, el papel de miR-29c en el cáncer de pulmón todavía no se ha explorado a fondo y la mayor parte de su función biológica en general sigue siendo desconocido. Aquí, se muestra evidencia de que las funciones de miR-29c como un supresor de la metástasis que inhibe la adhesión de células de cáncer de pulmón de ECM y la migración
in vitro
, y suprime las células del cáncer de metástasis a distancia
in vivo
. Además, confirmó que el miR-29c puede regular a la baja directamente β1 integrina y la expresión de MMP-2 por la orientación de la '-untranslation secuencia 3, inhibir los niveles de la proteína integrina β1 y la MMP-2, y reducir la actividad de la enzima MMP-2. Los resultados muestran que el miR-29c puede ser una nueva diana terapéutica candidato o estrategia para tratar de controlar la metástasis del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Ética
Todos los experimentos con animales se realizado utilizando ratones desnudos hembra (6-7 semanas de edad). Los ratones fueron adquiridos de Laboratorio Animal SLAC Ltd., Co. (Shanghai, China) y se cuidan de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los animales protocolo experimental fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Tongji (IACUC Nº 1201).
Líneas celulares y cultivo celular
El 95C bajo metastásico emparejado y alta metastásico líneas de células 95D se subclonaron a partir de un pulmón de células línea humana diferenciada bajo el carcinoma de células grandes PLA-801. Las células fueron bien autenticadas y publicadas por varios grupos de investigación [14], [15]. Las células fueron amablemente proporcionados por el profesor Ying-Lin Lu, Departamento de Patología, Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia Militar de Ciencias Médicas, Beijing, China en diciembre 5,2009. Como se describe El 95C y 95D células se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen, EE.UU.) con 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino de ternero al 10%, y se cultivaron a 37 ° C en atmósfera con 5% de CO
2. Las células se utilizaron para estudios funcionales dentro de los 6 meses después de thawn del tanque de nitrógeno líquido.
Los microARN matriz y QRT-PCR análisis
Después de realizar un ensayo de migración sencilla a la pantalla de alta y de baja células metastásicas , se realizó un ensayo transwell como un índice de invasión de Matrigel
in vivo usando
no invasiva 95c células en la cámara superior de la no recubierta transwell insertar (24 pocillos de inserción; tamaño de poro 8 micras; Corning, EE.UU.) y 95D células en la parte inferior con un Matrigel (50 mg /ml), recubierta transwell insertar para amplificar la expresión diferencial de miRNAs. Entonces miRNAs expresión diferencial entre 95C y 95D se midió utilizando una matriz de miR human_01_H10.1_080277 miARN (Ciencias LC Houston, EE.UU.). Todos los datos se depositan en la Expresión Génica Omnibus (GEO). El número de acceso es GSE47788. El miRNAs medidos con una diferencia estadística (
p Hotel & lt; 0,01). Se considera que es significativamente expresados diferencialmente
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR) se llevó a cabo para medir los niveles de expresión 95c y 95d de las células. El ARN total de 95C y 95D de tipo salvaje se aisló utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (50 ng) fue inverso-transcrito con miR-29c cebadores tallo-bucle o cebadores RT RT U6 (Shanghai extendido Nature Biotech Co., Ltd) mediante el uso de un kit de RevertAid ™ primer capítulo de síntesis de cDNA (Fermentas, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante para formar cDNA. PCR en tiempo real se realizó con un kit de SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Takara, Japón) con miR-29c o cebadores de PCR U6 (Shanghai extendido Nature Biotech Co., Ltd). Las reacciones se realizaron usando un sistema de PCR en tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems). Se recogieron todos los datos para cada muestra por triplicado y se evaluó a través de 2
-ΔΔCt análisis cuantitativo relativo.
Ganancia de la función y la pérdida de función de miR-29c
La con ganancia de función de ensayo mediante imita el miR-29c y el ensayo de pérdida de función por el inhibidor de miR-29c
in vitro
se llevaron a cabo mediante transfección de células usando el método mencionado a continuación. Las secuencias de oligonucleótidos de imita el miR-29c, inhibidor y su control negativo son:
imita el miR-29c (29c):
Sentido: 5'-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 ', España
anti-sentido: 5'-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 ';
imita el miR-29c control negativo (MiNC):
sentido: 5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3', España
anti-sentido: 5'-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ';
inhibidor de miR-29c (29ci): 5'-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3'
control negativo inhibidor de miR-29c (IhNC): 5'-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 '.
Todos estos oligonucleótidos se chemosynthesized del Extended Nature Biotech, Shanghai.
transfección celular
Las células 95C o 95D fueron cultivadas a aproximadamente 80 % de confluencia en placas de 6 pocillos y se transfectaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos se transfectaron con 100 imita nM o 200 nM inhibidor. 24-48 horas después de la transfección, se recogieron las células para experimentos adicionales, incluyendo la proliferación, adhesión, migración, e invasión.
Ensayos de proliferación celular
La proliferación de las células transfectadas fueron evaluados por MTT ensayo. Acerca de 2 × 103 células se sembraron en una placa de 96 pocillos con 100 l de medio en cada pocillo. Después de 24 h, 48 h se añadieron 20 l de MTT (5 mg /ml) en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 4 h antes de leer a 530 nm en un lector de placas de 72 h y 96 h,. Todos los experimentos independientes se realizaron por triplicado.
Cell adhesión a los ensayos de la matriz extracelular (ECM)
La adhesión de las células transfectadas a Matrigel se evaluaron mediante el ensayo de MTT y contando. En el ensayo de MTT, las placas de 96 pocillos fueron pre-recubierto con 40 l de 50 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences, EE.UU.) y luego 1 x 104 células se sembraron en cada pocillo en una placa de 96 pocillos con 100 l de medio y las células se incubaron a 37 ° C durante 2 h. A continuación se realizó el ensayo de MTT descrito anteriormente después de tres veces lavando las células no adherentes con PBS. En el ensayo de recuento, la 95D y 95C células fueron transfectadas con lentivirus de NC-CMV-GFP-LV (Shanghai Genechem) para expresar de forma estable el gen GFP. Las células 95D-GFP y 95C-GFP se transfectaron con 100 imita nm o 200 inhibidor nM, respectivamente, se trataron con tripsina, se lavaron dos veces en 1 x PBS, y luego 1 x 104 células con 100 l de medio se sembraron en cada pocillo en un 96 pocillos placa previamente recubierta con 40 l de 50 mg /ml de Matrigel y las células se incubaron a 37 ° C durante 30 células no adherentes min.El se lavaron 3 veces con PBS, y el número de células que se adhieren a Matrigel se contaron bajo un microscopio invertido (Olympus Corp. de Tokio, Japón) a 100 × magnificación de 3 verdes campos seleccionados al azar en cada pocillo. Los experimentos independientes se realizaron en tres ocasiones.
La migración celular y la invasión ensayos
El potencial para la migración y la invasión de las células transfectadas se evaluaron mediante un ensayo transwell. En el ensayo de migración, 2,5 x 104 células se cultivaron en 200 l de medio con suero bovino de ternero al 1% en la cámara superior de un inserto no recubierto transwell. En la cámara inferior, se utilizó 600 l de medio con suero bovino de ternera al 10% como un quimioatrayente para estimular la migración celular. En el ensayo de invasión, la cámara superior de los insertos transwell se revistieron con 50 l de 2,0 mg /ml de Matrigel, y 5 × 104 células se sembraron en la cámara superior del inserto Transwell recubierto con Matrigel. Las células de ambos ensayos se incubaron durante 24 horas y las células que no migraron o invaden fueron eliminadas mediante un hisopo de algodón. Todas las células se tiñeron utilizando la tinción de cristal violeta y se contaron bajo un microscopio invertido. Se seleccionaron al azar cuatro vistas para contar las células y los experimentos independientes se repitieron tres veces.
Determinación de miR-29c direccionamiento de secuencias de predicción computacional
predicción computacional ya ha sido demostrado ser una eficaz y un método eficiente para la predicción de los objetivos de miARN. Utilizamos TargetScan, PicTar y Miranda para predecir el miR-29c direccionamiento de secuencias. Objetivos que fueron predichas por las tres bases de datos y estaban relacionados con la invasión tumoral y la metástasis se consideraron relevantes para nuestra investigación.
ensayo de luciferasa Dual-para determinar los efectos de las secuencias diana de la región 3'-UTR de integrina β1 y MMP2
el fragmento 3'-UTR de los genes β1 integrina y MMP2, incluyendo el sitio de unión de miR-29c, se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de la célula 95D usando los siguientes cebadores. cebadores de PCR para la integrina β1 fueron:
Intβ1-
Sal
I-UTR1, 5'-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 '(hacia adelante), Francia
Intβ1-
Mlu
I-UTR2, 5'-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 '(inverso)
cebadores de PCR para la MMP-2 fueron:.
MMP2-
Mlu I-
UTR1, 5' -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 '(hacia adelante), MMP2-
Hind III-
UTR2, 5'-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3' (hacia atrás).
El β1 integrina y MMP2 gen mutante 3'-UTR fragmento que contiene el sitio de unión de miR-29c se amplificó a partir del fragmento 3'-UTR utilizando los siguientes cebadores para la integrina β1 por Intβ1-
Sal
I-UTR1 + Intβ1-
Mlu I-
mut
-UTR3 (5'-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 ') y de la MMP-2 por MMP2-
Mlu I-
UTR1 + MMP2-
Hind III
-mut -.
UTR (5'-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 ') (bases subrayadas indican el sitio de la mutación)
el fragmento amplificado se clonó en el vector PMIR-INFORME luciferasa (Ambion, EE.UU.) en el
Sal
I +
Mlu
I
y Mlu
I +
Hind III
sitio de la integrina β1 y la MMP-2, respectivamente.
El 95C o 95D Las células fueron co-transfectadas en placas de 24 pocillos que contenían 200 ng de luciferasa de luciérnaga vector, 40 ng
Renilla luciferasa
pRL-TK vector (Promega, EE.UU.) y 100 nm o 200 imita inhibidor nM. La luciferasa de luciérnaga actuó como un gen reportero y
Renilla luciferasa
como control normalizado. Se incubaron las células transfectadas durante 48 h. La actividad de luciferasa se midió usando el Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, EE.UU.).
Western blotting
Para el aislamiento de las proteínas totales, células tratadas y de control se lavaron con 1 x PBS, se lisaron con tampón RIPA (50 m mol /L Tris-base, 150 m mol /L de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, /L ortovanadato de sodio 1 m mol, 10 m mol /L de sodio fluoruro, 1% de cóctel inhibidor de la proteasa) durante 15-20 min en hielo. Después de centrifugación a 12.000 rpm durante 15 min, se recogieron los sobrenadantes. y la concentración de proteína se cuantificó por el ensayo de proteína BCA. 20 a 30 g de proteínas totales se disolvieron en tampón de carga de SDS-PAGE, se calentó a 100 ° C durante 5 min, se separó en gel de poliacrilamida al 10%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Biosciences). Las membranas se bloquearon en leche 5% sin grasa en tampón TBST (Tris Buffer Saline que contiene 0,1% de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente, y posteriormente se incubaron durante la noche a 4 ° C por los anticuerpos primarios apropiadamente diluida para monoclonal anti conejo humana- β1 integrina y la MMP-2 (diluido 1:1000; Cell Signaling Technology). Después de un extenso lavado con tampón de TBST, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un extenso lavado con tampón TBST, proteínas diana fueron detectados por un aumento de quimioluminiscencia ECL reactivos.
Gelatina zymography de la actividad de la enzima MMP-2
Este experimento buscaba para detectar la MMP-2 y la actividad enzimática específica MMP9. Los medios de comunicación sin el suero recogido de la 95C transfectadas y 95D células después de 24 horas se analizaron usando un kit de ensayo de zimografía de gelatina (Applygen, China). la actividad de MMP se midió mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El gel contenía 1% de gelatina y 30% de acrilamida. La electroforesis se llevó a cabo a 4 ° C. Después de lavar con el tampón A (que contiene 2% de Triton X-100) del kit, el gel se incubó en 37 ° C con el tampón B (que contiene el ion metálico es necesario: 5 mmol /CaCl
2, 1 mol /L ZnCl
2). MMP actividad fue visualizado por tinción con Coommasie Blue R-250.
En vivo ensayos de metástasis en ratones nude modelo de xenoinjerto
El 95D y 95C células fueron transfectadas con lentivirus de U6-RNAi- (Ubi ) -luc-LV (Shanghai Genechem) para expresar de forma estable la luciferasa de luciérnaga en células de cáncer de pulmón. Las células 95D-Luc y 95C-Luc se transfectaron con 100 imita nM o 200 nM inhibidor, respectivamente, con tripsina, se lavaron dos veces en 1 x PBS, y se resuspendieron a una concentración de 1-5 x 10
6 células /ml en frío 1 × PBS. ratones desnudos hembra (6-7 semanas de edad) se anestesiaron por inyección intraperitoneal de ketamina (90 a 110 mg /kg) y xilazina (10 mg /kg) antes de las inyecciones intracardiacas y se colocaron en la posición supina. Con una aguja de calibre 25, 2-3 x 10
5 células se inyectaron en el ventrículo izquierdo (volumen 0,1 ml) después de la visualización del flujo sanguíneo arterial en la jeringa. Después de la inyección, los ratones se colocaron en jaulas de calefacción para recuperarse de la anestesia. Los animales inyectados con células fueron alojados en condiciones estériles en las instalaciones de Experimentación Animal de la Universidad de Tongji (Shanghai, República Popular de China)
.
En el
in vivo
ensayo de metástasis, metástasis de cáncer de pulmón se controló en el animales que viven por bioluminiscente de imágenes (BLI) utilizando un sistema de imagen 983 LB in-vivo (Berthold) a partir de 3-4 semanas después de la implantación. Quince minutos antes de
in vivo
BLI, los animales se anestesiaron con isoflurano 1-3% y se inyectaron por vía intraperitoneal con D-luciferina (150 mg /kg en 1 × PBS). Los experimentos se realizaron con 5 o 6 ratones por grupo y tres veces repetido. El desarrollo de las metástasis óseas se controló mediante radiografía de rayos X durante 6-8 semanas después de la inyección. Los ratones fueron anestesiados, colocado en una tarjeta transparente en decúbito prono y lateral, expuesta a los rayos X a 30 kV y 0,5 mA durante 10 s en un sistema de radiografía Fixitron MX-20 en el Instituto de Traumatología & amp; Ortopedia, Academia de Shanghai de Medicina Tradicional China.
El análisis estadístico
Las variables cuantitativas se presentan como media ± SEM. de Student
t
y χ
2 pruebas se llevaron a cabo para comparar los datos correspondientes. Las diferencias con
P
. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
miR-29c es el regulado en células de cáncer de pulmón metastásico de alta
en este estudio, se seleccionaron los 95C y 95D líneas celulares, ya que se originaron de la misma persona y hay una gran diferencia en su comportamiento metastásico. Para identificar la expresión diferencial de miRNAs entre 95C y 95D células. En primer lugar, una selección primaria se llevó a cabo utilizando un simple ensayo de invasión Transwell Matrigel matriz antes de miARN. Encontramos una significativa expresión diferencial de miRNAs entre 95C y 95D células por medio de matriz miARN (detalles en la Tabla S1). Para estudiar el posible papel de los miRNAs que inhiben la metástasis de pulmón de células cancerosas y potenciales candidatos se dirigen a los genes, nos centramos en el miR-29c, ya que es el regulado en las células de alto metastásico 95D y hasta regulado en células 95C de baja metástasis. El hallazgo puede implicar la función de miR-29c como un supresor de la metástasis tumoral. Los datos de QRT-PCR confirmó además los diferentes niveles de expresión de miR-29c entre 95C y 95D células. Este resultado es consistente con los resultados de la matriz miARN. (MIR-29c mostró unas 3,8 veces veces mayor en 95C 95D de la Figura 1A).
QRT-PCR de miR-29c en 95D y 95C de células líneas (A). El cambio se calculó mediante el análisis cuantitativo 2 relativa
-ΔΔCt; **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
t-test
). Los experimentos se repitieron al menos tres veces (n = 3). (B) miR-29c inhibe la proliferación celular en las células 95D mediante el ensayo de MTT. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
t-test
, n = 3). (C) inhibidor de miR-29c aumento de la proliferación celular en las células 95c mediante el ensayo de MTT. ** P
. & Lt; 0,01 proliferación celular (de Student
t-test
, n = 3) guía empresas
suprime el miR-29c en células 95D
Para determinar si miR-29c suprime la proliferación de células de cáncer de pulmón, imita el miR-29c (miR-29c) y control negativo imita (MiNC) se transfectaron en 95D células, mientras inhibidor de miR-29c (29ci) e inhibidor de control negativo ( IhNC) se transfectaron en células 95c. Se llevaron a cabo ensayos de MTT para medir la proliferación celular. Resultados (Figura 1B) sugieren que miR-29c tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación de células 95D. No hubo diferencias a las 24 h en la proliferación de células 95D entre los grupos MiNC miR-29c y (
p Restaurant & gt; 0,05). Sin embargo, hubo una diferencia significativa entre los dos grupos después de 48 h, 72 h y 96 h de incubación (
p
& lt; 0,01). Las eficacias inhibidoras fueron 37,5%, 54,4% y 40,3% (Figura. 1B), respectivamente. Por lo tanto, la inhibición de miR-29c de la proliferación de células 95D es un proceso dependiente del tiempo.
En 95c células transfectadas con inhibidor de miR-29c (miR-29ci), aumento de la proliferación de una manera dependiente del tiempo. Las tasas de proliferación entre los grupos de miR-29ci y IhNC no variaron (
p Hotel & gt; 0,05) en el punto de incubación de 24 h. Sin embargo, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos después de 48 h, 72 h y 96 h de incubación con las tasas de proliferación de 15,2%, 13,7% y 10,4% (Figura 1C,
p
& lt; 0,01), respectivamente. Por lo tanto, el miR-29c promovió la proliferación celular 95C de una manera dependiente del tiempo.
miR-29c inhibe la adhesión celular a ECM in vitro
La adhesión a ECM es un paso clave cuando las células cancerosas plantan en lugares distantes durante la metástasis. Matrigel que contiene los componentes de la membrana basal puede simular la adhesión celular
in vitro.
Nos tomó ventaja de esta propiedad y se realizó un ensayo de adhesión. En 95D células transfectadas con imita miR-29c (miR-29c) y control negativo (imita MiNC), el número de células que se adhieren a la Matrigel disminuyó significativamente (
p
& lt; 0,01, Figura 2 A-C ) después de la transfección de miR-29c en comparación con las transfectadas con MiNC. Sin embargo, en 95c células transfectadas con inhibidor de miR-29c (29ci) y el inhibidor de control negativo (IhNC), inhibidor de miR-29c se ha incrementado significativamente la adhesión 95C de matrigel cuando las células transfectadas con el inhibidor de miR-29c en comparación con las transfectadas con IhNC (
p
& lt; 0,01, Figura 2 D-F). Estos resultados indican que el miR-29c puede disminuir el número de células de adhesión en la metástasis de alto 95D células, mientras que la inhibición de la MIR-29c adhesión celular en las células metastásicas bajo 95C (Figura 2) puede incrementado.
( a) 95D células transfectadas con imita miR-29c adhesión a Matrigel se midió contando como se describe en Materiales y Métodos. campos representativos de 95D y 95D 29c MiNC (aumento x 100). (B) el número de células de adhesión media por campo aleatorio. **
P Hotel & lt; 0,01 (de Student
t-test
, n = 3). (C) miR-29c inhibe la adhesión de células 95D (ensayo MTT). **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
t-test
, n = 3). (D) campos representativos de 29ci 95D y 95C células de cáncer de pulmón IhNC (aumento x 100). (E) el número de células de adhesión media por campo aleatorio. **
P Hotel & lt; 0,01 (de Student
t-test
, n = 3). (F) La supresión de miR-29c adhesión celular mejorada en 95C células (ensayo MTT). **
p
. & Lt; 0,01 (de Student
t-test
, n = 3) guía empresas
miR-29c inhibe la invasión y la migración celular in vitro
transwell ensayo es ampliamente utilizado para medir el comportamiento celular durante la migración y la invasión, los pasos claves en la metástasis tumoral. Hemos establecido una membrana de Matrigel o transwell sí con una quimio-atrayente para simular la invasión celular y el comportamiento de migración
in vitro
. En 95D células después de miR-29c y transfección Minc, una diferencia significativa visible fue visto con un menor número de células miR-29c transfectadas contados a que las células MiNC transfectadas (número de células reduce 104,2% en el ensayo de migración y 136% en el ensayo de invasión,
p
& lt; 0,01). Este hallazgo puede indicar que la regulación al alza de miR-29c inhibe la invasión celular y la migración (Figura 3A y B). Por el contrario, la transfección de células con 95C inhibidor de miR-29c y IhNC mostró un resultado opuesto; inhibidor de las células transfectadas más miR-29c pasaron por el matrigel y la membrana Transwell (el número de células aumentó aproximadamente un 79,7% en el ensayo de la migración y el 97,4% en el ensayo de invasión,
p Hotel & lt; 0,01) en comparación con las células 95c transefected con IhNC (Figura 3 C y D). Estos datos muestran que el miR-29c influenciada invasión celular y el comportamiento de migración
in vitro
.
(A) En un ensayo de invasión de Matrigel, imita el miR-29c transfectaron células 95D vs MiNC transfectaron células en una 200 × alcance la luz después de tinción con cristal violeta. (B) la invasión de Matrigel y migración transwell: 95D células se contaron en un ámbito de luz en cuatro vistas al azar. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
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, n = 4). (C) En un ensayo de invasión de Matrigel, inhibidor de miR-29c 95c transfectaron células frente a las células transfectadas IhNC en un ámbito de luz 200 × después de tinción con cristal violeta. (D) la invasión de Matrigel y migración transwell: 95c células se contaron en un ámbito de luz en cuatro vistas al azar. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
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, n = 4)
miR-29c se dirige directamente a 3'-UTR de la integrina. β1 y el gen de la MMP-2
Para explorar más a fondo los mecanismos por los que el miR-29c suprime la invasión de células de cáncer de pulmón y metástasis, se analizaron los genes relacionados con la metástasis de tumores aguas abajo probables. predicción computacional se utilizó para encontrar el gen diana más probable. Nos aprovechamos de las bases de datos TargetScan, PicTar y Miranda de objetivos de microARN predichos para analizar taregets de miR-29c. Los 3'-UTR de la integrina β1 (Intβ1) y MMP-2 llevan los sitios de unión de miR-29c. 3'-UTR de la integrina β1 y MMP 2 de miR-29c-vinculante sitios tienen secuencias muy conservadores en los mamíferos (Figura 4A y D). Los estudios sobre las funciones putativas de miR-29c en la adhesión celular y la invasión nos animaron a seguir investigando en β1 integrina y MMP2.
(A) focalización conservadas de 3'-UTR del ser humano int β1 por miR 29c (subrayado). La de tipo salvaje y mutantes de secuencias int β1 3'-UTR se enumeran para la comparación. (B) ensayo indicador de luciferasa Dual-gen diana para int β1 en las células transfectadas con 95D imita el miR-29c. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
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, n = 3). (C) ensayo indicador de luciferasa Dual-gen diana para int β1 en células 95C con o sin inhibidores de la transfección de MIR-29c. **
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, n = 3). sitios en la región 3'UTR MMP2 unión (D) miR-29c (subrayado); sitio de unión es muy conservadas en los animales vertebrados, incluidos los humanos. Las secuencias de tipo salvaje y mutantes de la MMP-2 3'UTR se enumeran para la comparación. (E) ensayo indicador de luciferasa Dual-de MMP-2 mRNA en células 95D transfectadas con imita el miR-29c. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
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, n = 3). (F) ensayo indicador de luciferasa Dual-de MMP-2 mRNA en células 95C con o sin inhibidores de la transfección de MIR-29c. **
p Hotel & lt; 0,01 (de Student
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, n = 3) guía empresas
Para determinar si la integrina β1 y MMP2 son suprimidas por miR. 29c a través de la unión a su mRNA 3'-UTR, se realizó un ensayo de luciferasa dual para verificar la relación entre el gen diana y dos miR-29c. La de tipo salvaje y mutante β1 integrina y MMP 2 mRNA 3'-UTR se insertaron en la región aguas abajo de un gen informador de luciferasa de vector PMIR-REPORT, y a saber, la integrina β1 vector 3'-UTR de tipo salvaje, MMP 2 3 "vector-UTR, la integrina mutante vector β1 3'-UTR y MMP2 mutante 3'-UTR del vector, respectivamente. Se utilizó el vector de luciferasa PMIR-INFORME como control, ya que no se vería influenciada por cualquier imita el miR-29c o inhibidor, y también puede actuar como un control estándar para la eficacia de transfección. Por lo tanto,
Renilla luciferasa Gráficos vectoriales (PRL-TK vector) y el vector de luciferasa de luciérnaga se co-transfectaron con imita o inhibidor. En 95D células con imita miR-29c, la actividad luciferasa de tipo silvestre-β1 integrina y el vector de MMP2 proporción relativa se inhibió aproximadamente 2,00 veces en comparación con el control (Figura 4 B y C,
p Hotel & lt; 0,01) . Aunque la integrina β1 mutante y vector MMP2 en 95D células mostraron una actividad de la luciferasa bajo que el control, no hubo diferencia significativa (
p
& gt; 0,05). En 95c células, la inhibición de miR-29c tiene aumento de β1 integrina y la actividad de MMP2 luciferasa (Figura 4 E y F
p
& lt; 0,01) en comparación con las células que no se estimularon con inhibidor de miR-29c debido a la β1 integrina y la actividad luciferasa MMP2 vector, que fue inhibida por endógena miR-29c. Del mismo modo, β1 integrina mutantes y MMP2 en 95c células no mostraron ninguna reacción significativa con el control (
p
& gt; 0,05). Al parecer, el miR-29c se dirige β1 integrina y la MMP-2 directamente desde la ganancia de la función de miR-29c en 95D células disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa β1 integrina y vector de la MMP-2, y la pérdida de función de inhibidor de miR-29c en 95C células mostraron que la integrina β1 y la MMP-2 mantiene su nivel de expresión sólo cuando las células no están expuestas al inhibidor de miR-29c (Figura 4).
miR-29c inhibe la expresión de la proteína endógena de la integrina β1 y MMP2
Para investigar más a fondo los efectos de miR-29c de la integrina β1 y la proteína MMP-2 expresión por Western Blot. En 95D células transfectadas con imita miR-29c, la expresión de la integrina β1 y MMP2 en los niveles de proteína fueron significativamente menor que la del control negativo de las células transfectadas con MiNC (Figura 5,
p
& lt; 0,01) . En 95c células, en comparación con las células transfectadas con IhNC, los resultados de transferencia Western indicaron β1 integrina y la expresión de MMP2 preotein se upregulated después transfectadas con inhibidor de miR-29c en 95C (Figura 5,
p
& lt; 0,01). Estos datos muestran la integrina β1 y la MMP-2 son blancos directos de miR-29.
(A) Efectos de miR-29c en la integrina β1 endógena de proteínas.