Extracto
Helicobacter pylori gratis (
H
pylori
) es una bacteria Gram-negativa con forma de espiral que causa la infección crónica más común en el estómago humano. Aproximadamente el 1% y el 3% de las personas infectadas desarrollan cáncer gástrico. Sin embargo, los mecanismos por los que
H
.
pylori
induce el cáncer gástrico no se entienden completamente. La evidencia disponible indica una fuerte relación entre el factor de virulencia de
H
.
pylori
, el gen asociado a la citotoxina A (CagA), y cáncer gástrico. Para caracterizar mejor
H
.
pylori
virulencia, hemos establecido tres líneas celulares mediante la infección de las líneas celulares de cáncer gástrico SGC-7901 y AGS con
cagA
+
H
.
pylori Opiniones y transfección de SGC-7901 con un vector que lleva el de larga duración
cagA
gen. Detectamos 135 proteínas expresadas de forma diferente a partir de las tres líneas celulares que utilizan la tecnología proteoma, y 10 proteínas diferenciales comunes a las tres líneas celulares fueron seleccionados e identificados por LC-MS /MS, así como verificadas por Western blot: ß-actina, L-lactato deshidrogenasa (LDH), deshidrogenasa dihidrolipoamida (sistema antibloqueo de frenos), pre-mRNA de procesamiento de factor de 19 homólogo (PRPF19), ATP sintasa, calmodulina (CaM), CLCP p64, la proteína específica-Ran GTPasa de la activación (RanGAP), P43 y calreticulina. La detección de la expresión de estas proteínas y genes que codifican estas proteínas en los tejidos de cáncer gástrico humano por PCR en tiempo real (RT-qPCR) y Western blot reveló que la expresión de
β-actina
,
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
,
PRPF19
y
CaM
genes fueron reguladas y
RanGAP
se había reducido regulado en los tejidos de cáncer gástrico y /o ganglios linfáticos metastásicos en comparación con los tejidos peri-cancerosos. Se observó alta expresión de genes para
H
.
pylori
infección en tejidos de cáncer gástrico. Por otra parte, el
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
y
CaM
genes fueron desmetiló en el promotor -2325, -1885 y -276 sitios, respectivamente, y el
RanGAP
gen fue muy metilado en el promotor -570 y -170 en sitios
H
.
pylori
infectado con y
cagA
células overexpressing. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los objetivos patogénesis y tratamiento moleculares para el cáncer gástrico con
H
.
pylori
Visto:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, X Chen, Xu W, et al. (2016) La proteómica basada en la identificación y análisis de proteínas asociadas con
Helicobacter pylori Hoteles en cáncer gástrico. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 15 Septiembre, 2015; Aceptado: 19 de diciembre de 2015; Publicado: 8 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. el trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81260303, 31560326), la provincia de Guizhou fundación (QianJiaoHe [2014] 06) y el Proyecto clave de Ciencia y Tecnología de Guizhou provincia (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). En la versión original, el trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81260303, 31560326) y el Proyecto Clave de Ciencia y Tecnología de la provincia de Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067): perfil
Conflicto de intereses:. La autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
Helicobacter pylori gratis (
H
.
pylori
) hace que la mayor parte infección estomacal crónica común en los seres humanos en todo el mundo. Aproximadamente la mitad de la población mundial está infectada con el
H
.
pylori
, y la mayoría de los individuos colonizados desarrollan gastritis asintomática. Entre los individuos infectados, aproximadamente el 10% -20% de los individuos a desarrollar enfermedades de úlceras pépticas y 1% -3% desarrollan cáncer gástrico [1,2]. En 1994,
H
.
pylori
fue clasificado como un carcinógeno tipo I para el cáncer gástrico mediante la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud.
El cáncer gástrico es uno de los tipos más comunes de cáncer, y más de 70% de los nuevos casos y muertes se producen en países en desarrollo [3]. A pesar de que la tasa de incidencia global ha ido disminuyendo desde hace varias décadas, el cáncer gástrico sigue siendo frecuente en la mayoría de los países en desarrollo, entre ellos Japón, Corea y China [4-6]. En 2012, el Informe Anual de Registro de Cáncer de China indicó que la morbilidad y la mortalidad del cáncer gástrico son segundo y tercero entre todos los tumores malignos, respectivamente.
La mayoría de los
H
.
pylori cepas
llevan el
cag
isla de patogenicidad (
cag
PAI), que contiene 27 a 31 genes que codifican un sistema de secreción de tipo 4 bacteriana (T4SS) [7] . El gen asociado a la citotoxina un gen (
cagA
), que se encuentra en el extremo 3 'de
cag
PAI, codifica la oncoproteína bacteriana única conocida, CagA, que se transloca en las células huésped por T4SS después de la fijación bacteriana al estómago. Una vez dentro de las células huésped, CagA es tirosina fosforilada por los miembros de las familias de quinasas Abl y Src e interactúa con numerosos efectores intracelulares, lo que conduce a la activación de moléculas de señalización corriente abajo [8]. En estudios clínicos,
cagA
cepas -positivos se han relacionado consistentemente a la inflamación gástrica más graves y úlceras, y una pequeña fracción de los individuos desarrollar cáncer gástrico [9]. Sin embargo, no se han elucidado los mecanismos que subyacen a la asociación de CagA con cáncer.
Proteómica ha surgido como una plataforma tecnológica prometedora para la identificación racional de los biomarcadores y nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades y la determinación de los mecanismos subyacentes de carcinogénesis [10]. Sin embargo, la mayoría de las proteínas importantes detectadas por la proteómica in vitro no han sido confirmados in vivo en muestras clínicas.
metilación del ADN y la desmetilación juega un papel importante en el desarrollo y progresión de cánceres mediante el bloqueo de la unión de factores de transcripción al ADN y es se produce casi exclusivamente en el promotor del gen islas CpG [11-13]. Entre los órganos, el estómago exhibe la más alta frecuencia de metilación anormal isla CpG, posiblemente
H
.
pylori
mediada [14-16]. Aunque los estudios de metilación del ADN están aumentando, los estados de metilación de genes inducidos por
H
.
pylori
aún no están claros.
En este trabajo, que tuvo como objetivo identificar las proteínas específicas relacionadas con
H
.
pylori
infección usando la proteómica comparativa y caracterizar la expresión génica y la isla CpG metilación de estas proteínas en los tejidos de cáncer gástrico y células
Materiales y Métodos
tejidos humanos.
Los tejidos humanos se obtuvieron a partir de especímenes quirúrgicos de 30 pacientes con cáncer gástrico y combinar los tejidos de cáncer adyacentes y los ganglios linfáticos metastásicos en el hospital Médico Guiyang, Guiyang china, entre enero de 2009 y junio de 2010. Los diagnósticos fueron confirmados por dos patólogos. Entre los pacientes, 23 eran hombres y 7 eran mujeres. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 38 y 77 años. Veintidós pacientes tenían adenocarcinoma tipo intestinal, y tenía 8-adenocarcinoma tipo difuso. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Medicina de Guiyang, y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito.
Cultivo de células
La línea celular de carcinoma gástrico humano AGS (ATCC CRL-1739TM) y células SGC-7901 se adquirieron directamente de la American Type Culture Collection (ATCC) y el Banco de células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), respectivamente, y se pasaron por menos de 3 meses en nuestro laboratorio después de la recepción. Las células se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO
2.
H
.
pylori Francia culture
H
.
pylori
cepa NCTC11637 (ATCC 43504, un regalo del Centro Chino de
Helicobacter pylori cepa
Gestión y Preservación, Pekín, China), que es
cagA
positivo, se crecido en un medio selectivo en una placa agar Columbia que contiene 10% de suero de ternera fetal y
H
.
pylori
Suplemento Selectivo (Oxoid Ltd, Inglaterra) a 37 ° C en condiciones microaerobias.
infección celular con
H
.
pylori
AGS y células SGC-7901 (5 × 10
5) fueron sembradas en placas de 6 pocillos durante 24 horas y infectadas con
H
.
pylori Opiniones de 6 h y 12 h en una multiplicidad de infección (MOI) de 1: 100, 1: 500 y 1: 1000, respectivamente. Las células se infectaron durante 12 horas a una MOI de 1: 1000 con
H
.
pylori
hierve durante 15 minutos como controles.
Construcción del vector de expresión pcDNA3.1 /
cagA
Se extrajo ADN de
H
.
pylori
, y el de larga duración
cagA
secuencia se sintetizó mediante PCR y se clonaron en plásmidos pMD18-T para construir pMD18-T /
cagA
. El
cagA
gen fue identificado por secuenciación (GQ161098). pMD18-T /
cagA
se digirió con las enzimas de restricción
Pst I y
Bam HI
, y
cagA
se ligó en pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, EE.UU.) para construir el vector de expresión eucariota pcDNA3.1 /
cagA
. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla 1.
transfección celular con pcDNA3.1 /
cagA
Se incubaron células SGC-7901 durante 12 h en placas de 6 pocillos para obtener un 80% de células confluentes. Las células se transfectaron a continuación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, las células se dividieron 01:10 en nuevas placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h adicionales y luego mantenidos en medio selectivo estándar que contiene zeocina (250 mg /ml) durante 2 semanas hasta que la formación clon. Las células transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío /Zeo (-) se utilizaron como controles
extracción de proteínas y Western blot
Los extractos de proteína se prepararon resuspendiendo los sedimentos celulares en un tampón RIPA o la homogeneización de 200. tejidos mg en un tampón RIPA. Un total de 30 a 50 g de extracto de proteína se sometió a electroforesis en gel de SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y se transfirieron durante la noche con anticuerpo anti-CagA monoclonal de ratón (1: 800, sc-28368), anticuerpo monoclonal de ratón anti-fosfotirosina (PY99, 1: 300, sc-7020), anticuerpo policlonal de conejo anti-beta actina (1: 500, ab189073), anticuerpo policlonal de conejo anti-LDH (1: 350 , ab125683), monoclonal de ratón anti-sistema antibloqueo de frenos (1: 800, SC-376890), policlonal de conejo anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), anticuerpo sintasa anti-ATP monoclonal de ratón (1: 300, ab54880), policlonal de conejo anti -calmodulina anbody (1: 250, ab208911), anticuerpo anti-RanGAP policlonal de conejo (1: 200, ab92360), anticuerpo anti-p64CLCP policlonal de conejo (1: 300, ab28722), anticuerpo anti-calreticulin policlonal de conejo (1: 350, AB4) y el anticuerpo monoclonal de ratón anti -dehydrogenase-gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH, 1: 8000) de Santa Cruz (CA, EE.UU.), Abcam (Cambridge, Reino Unido) y CangChen (Shanghai, china), respectivamente, en 5% solución salina BSA en Tris tamponada con y 0,01% de Tween-20. anticuerpos conjugados con peroxidasa secundarios (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, EE.UU.) fueron utilizados y desarrollados con la ECL Plus quimioluminiscencia reactivo usando Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). La cuantificación de las transferencias Western se realizó mediante un software Cantidad. Cada experimento se realizó 3 veces, y se muestra un resultado representativo.
extracción de proteínas y de dos dimensiones electroforesis en gel de
Los sedimentos celulares se disolvieron en tampón de lisis celular durante la noche a 4 ° C, y proteínas se precipitó con tres volúmenes de acetona enfriada en hielo mediante la incubación a 4 ° C durante 2 h. Las muestras se centrifugaron a 20.000 rpm durante 30 min, y los sedimentos se resuspendieron en tampón de lisis celular y se almacenaron a 4 ° C durante la noche.
Un total de 800 g de proteína se ajustó a un volumen de 250 l con solución de rehidratación, y el enfoque isoeléctrico (IEF) se realizó usando un sistema de enfoque isoeléctrico Ettan IPGphor II (Amersham Biosciences) según las instrucciones del fabricante. El protocolo para el IEF de 300 V for1 h, 500 V durante 2,5 h, 1.000 V durante 2 h; 8000 V durante 8 h, 60 kVh (total).
Después de completar IEF, las tiras IPG (Amersham Biosciences) se equilibraron en tampón de equilibrado durante 15 minutos y se colocaron en un gel de SDS-PAGE 12% para dos electroforesis bidimensional a 30 mA /gel. El gel de SDS-PAGE resultante se fija en el 20% de TCA durante 30 minutos y luego se tiñó con Coomassie coloidal G-250 [5].
Las manchas de proteínas en el gel fueron escaneados y analizados de forma automática. manchas de proteínas expresados diferencialmente se confirmaron con Imaging Maestro 2D 5.0 software analítico (Amersham Biosciences). Se realizó la prueba t de Student para el análisis cuantitativo de los geles 2D. Expresión diferencial de una proteína específica se definió como un cambio ≥2 veces en la densidad óptica punto entre los dos conjuntos emparejados en duplicados. Los puntos diferenciales A continuación, se escindieron de los geles SDS-PAGE para su posterior identificación mediante LC-MS /MS.
extracción de RNA y RT-PCR cuantitativa
El ARN total fue extraído a partir de 50 mg de tejido y tratados con DNasa I (libre de RNasa). Los genes se amplificaron con verde SYBR (Applied Biosystems, Australia). Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (
HPRT
) se utilizó como un control de normalización, y los niveles de ARNm relativos se calcularon por un comparativo C
método t usando software Paso-uno (Applied Biosystems, Australia) [8]. Cada muestra se ensayó por triplicado, y los resultados se expresan como la media ± SD. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1.
extracción de ADN y análisis de metilación de islas CpG
ADN fue aislado de las células y modificado con bisulfito de sodio usando un DNA EZ metilación-Gold Kit
™ (Zymo Research, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Promotor islas CpG se prevé utilizar software de metilo Primer Express y se amplificaron a partir de ADN con bisulfito modificado por PCR utilizando los siguientes procedimientos: desnaturalización a 96 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 40 sec, hibridación a 60 ° C durante 40 seg, y elongación a 72 ° C durante 40 seg, con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR amplificados se clonaron en vectores de pMD19-T y se secuenciaron. Además, el ADN aislado de los tejidos tumorales se utilizó para detectar
H
.
pylori
16S
rRNA gen
y
cagA
gen. El primer secuencias se enumeran en la Tabla 2.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 15.0. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) y la prueba t de Student se utilizó para analizar los datos.
P
. & Lt; 0,05 (dos caras) fue considerado significativo
Resultados
Introducción de CagA en las células de cáncer gástrico
Debido a CagA de
H
.
pylori
es un factor de virulencia crítico en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico, CagA se detectó en las líneas celulares de cáncer gástrico por RT-PCR y Western blot después de la infección de SGC-7901 y las células AGS con
H
.
pylori Opiniones y transfección de células SGC-7901 con
cagA
-vector. La proteína CagA comenzó a aparecer en una proporción de células de bacterias de 1: 500 en células cultivadas a 6 h, y el contenido fue más alta en una proporción de 1: 1000 a las 6 h (Fig 1A y 1B). Sin embargo, se observó CagA fosforilada en las células en una proporción de 1: 500 después de cultivar durante 12 h, y se observó el contenido más alto en las células en una proporción de 1: 1000 después de 6 h de cultivo. CagA ARNm y proteínas también se observaron en forma estable
cagA
-overexpressing células SGC-7901 (Figura 1C y 1D). Estos datos sugieren que CagA se introdujo con éxito en las tres líneas celulares y fosforilada.
(A y B) Western blot de CagA CagA y fosforilada en
H
.
pylori
infectado con SGC-7901 (A) y células AGS (B). Las células infectadas con la relación indicada de células a
H
.
pylori
durante el tiempo indicado se recogieron y se lisaron, y las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE. Las células infectadas con
H
.
pylori
hierve durante 15 min a una MOI de 1: 1.000 se utilizaron como control. (C y D) La detección de ARNm y proteínas CagA en
cagA
-overexpressing células SGC-7901 por RT-PCR (C) y Western Blot (D). GAPDH sirvió como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Hp
,
H
.
pylori
; P-CagA, CagA fosforilada; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.
Identificación de proteínas diferenciales en células de cáncer gástrico
Después las células fueron infectadas con el
H
.
pylori
durante 6 horas a una MOI de 1: 1000 o transfectadas con
cagA
-vector, se utilizó una técnica de proteómica para crear seis electroforesis bidimensional (2-dE) a partir de los mapas de las tres líneas celulares y se detectaron sus respectivos controles (figura 2), y 135 puntos diferenciales, de los cuales 73 eran regulados hacia arriba y 62 se redujeron reguladas. Diez diferencial de puntos comunes a las tres líneas celulares fueron identificados por LC-MS /MS y verificados por Western blot, incluyendo 6 proteínas hasta reguladas: ß-actina, LDH, sistema antibloqueo de frenos, PRPF19, ATP sintasa y calmodulina (CaM), y 4 -regulado por proteínas como RanGAP, CLCP P64, P43 y calreticulina (Tabla 3 y figura 3A).
SGC-7901 y las células infectadas con AGS
H
.
pylori
durante 6 horas a una MOI de 1: 1000 (. Celda a
H
pylori
) y las células SGC-7901 transfectadas con pcDNA3.1 /
cagA
durante 48 h se recogieron y se lisaron, y las concentraciones de proteína se determinó a través de Bradford colorimetría. Un total de 800 g de proteína se cargó para la electroforesis en dos dimensiones. Las células infectadas con hervida
H
.
pylori
o transfectadas con el vector vacío sirvieron como controles para las células infectadas o transfectadas, respectivamente. células SGC-7901 (A) infectados con
H
.
pylori
. (B) las células infectadas con AGS
H
.
pylori
. (células C) SGC-7901 transfectadas con el
cagA
-vector. (D) la imagen magnificada de 10 puntos diferenciales. B4, B11, C6, C7, C8 y C9 manchas eran reguladas en marcha, mientras D12, D16, E11 E2 y manchas se redujeron reguladas. Estos puntos se identifican en la Tabla 3.
(A) Western blot de las proteínas indicadas en las células de control (1),
H
.
pylori
Las células infectadas con SGC-7901 (2) y
cagA
-overexpressed células SGC-7901 (3). GAPDH sirvió como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) El análisis cuantitativo de RT-PCR de los genes indicados en 30 tejidos de cáncer gástrico. Los valores se representan como la media Ct veces en comparación con los tejidos peri-cancerosas, donde los tejidos peri-cancerosas se establecen a 1. (C) Western blot de las proteínas indicadas en los 30 tejidos de cáncer gástrico. 200 mg tejidos se homogeneizaron y se recogieron las proteínas totales. Un total de 50 g extractos de proteína se sometieron a electroforesis en gel de SDS-PAGE. GAPDH sirvió como control de carga. (D) La detección de la
H
.
pylori
16S
rRNA gen
y
cagA
génica en tejidos de cáncer gástrico mediante PCR (Alto). M representa el marcador de peso molecular de ADN. El carril 1 es el control positivo. Carril 2 es el control negativo. Los carriles 3, 4 y 6 son muestras positivas. Carriles 5 son muestras negativas. Análisis cuantitativo de RT-PCR de los genes indicados en los tejidos de cáncer gástrico con y sin
H
.
pylori
infección (Baja). Los valores se presentan como la media Ct veces en comparación con el grupo sin
H
.
pylori
infección, que fue puesto a 1. La figura presenta el promedio de 30 muestras. Los datos se presentan como el medio ± SD. Las barras de error representan desviaciones estándar. LDH, L-lactato deshidrogenasa. Sistema antibloqueo de frenos, dihidrolipoamida deshidrogenasa. PRPF19, pre-procesamiento de mRNA del factor 19 homólogos. RanGAP, proteína GTPasa de la activación-Ran específico. CaM, calmodulina. CLCP p64, cloruro nuclear proteína de canal iónico. *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el tejido peri-cancerosos (B y C) y los tejidos sin
H
.
pylori
infección (D).
H
.
pylori
promueve la expresión de las proteínas diferenciales en tejidos de cáncer gástrico
Debido a
H
.
pylori coloniza
selectivamente el estómago humano para activar un conjunto de procesos patológicos, la expresión génica de 10 proteínas diferenciales en 30 muestras de cáncer gástrico humano se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa. De los 10 genes, la expresión de
β-actina
,
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
,
PRP19
y
Hoteles en la CAM cánceres gástricos y /o ganglios linfáticos metastásicos fueron reguladas en comparación con los tejidos peri-cancerosas, mientras que la expresión de
RanGAP
se había reducido regulado. Similarmente, las 6 proteínas también se expresaron de forma anormal en los mismos tejidos (Fig 3B y 3C). No se observaron diferencias significativas en la expresión de los otros genes.
H
.
pylori
la colonización en los tejidos de cáncer gástrico se midió mediante la detección de los 16S
rRNA gen
y
cagA
gen de
H
.
pylori fotos: por PCR.
H
.
pylori
estuvo presente en 20 de las 30 muestras positivas (tasa de 67%), y todos los
H
.
pylori
cepas son
cagA
positivo. Los niveles de mRNA de
β-actina
,
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
,
PRP19 y Cam
fueron mayores en
H
.
pylori
tejidos -positivos que en las muestras negativas (Figura 3D).
H
.
pylori
induce la metilación del ADN aberrante en células de cáncer gástrico
En tres líneas celulares, productos de PCR de las islas CpG de los genes anteriores se adquirieron con éxito después del tratamiento con bisulfito y secuenciado. En estos genes,
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
y
CaM
genes fueron desmetiló en el promotor -2325, -1885 y -276 sitios, respectivamente, y el
RanGAP
gen fue altamente metilada en el promotor -570 y -170 sitios (figura 4).
(a) el análisis electroforético de las islas CpG del promotor de los genes indicados por bisulfito de modificación-PCR. sitios (B) La metilación de las islas CpG en los promotores de los genes indicados.
LDH
, L-lactato deshidrogenasa.
sistema antibloqueo de frenos
, dihidrolipoamida deshidrogenasa.
RanGAP
, la proteína activadora de GTPasa Ran-específica.
CaM
, calmodulina. M, marcador de peso molecular. 1, las células no tratadas SGC-7901; 2,
H
.
células pylori
infectado con SGC-7901; 3,
cagA
-overexpressing células SGC-7901. Las flechas indican los sitios de metilación anormal.
Discusión
evidencia acumulativa indica que
H
.
pylori
es un factor importante para
H
.
pylori
-asociado enfermedades gástricas y que CagA es un factor promotor de cáncer gástrico [17,18]. Se construyeron tres líneas celulares experimentales, incluyendo dos líneas celulares de cáncer gástrico infectados con
H
.
pylori gratis (
cagA
+) y una línea celular de cáncer gástrico que sobreexpresan
cagA
, y determinó que CagA comenzó a aparecer en las células 6 horas después de la infección y para hasta 12 h. Posteriormente, CagA fosforilada comenzó a aparecer, en consonancia con la inyección y la posterior fosforilación de CagA en las células epiteliales gástricas por el T4SS de
H
.
pylori
después de la infección de la mucosa gástrica humana. Fosforilada CagA activa vías de señalización corriente abajo y juega un papel patológico. También observamos CagA en las células transfectadas de forma estable con el
cagA
-vector. Estos datos confirman la construcción exitosa de las tres líneas celulares experimentales.
La proteómica se ha utilizado para estudiar la relación entre los
H
.
pylori Opiniones y enfermedades gástricas, y muchas proteínas expresadas diferencialmente se han identificado [19-22]. Sin embargo, la asociación de estas proteínas con CagA y su expresión en tejidos de cáncer gástrico humano siguen sin estar claros. Se obtuvieron un total de 135 puntos diferenciales de las tres líneas celulares, de los cuales 73 fueron reguladas y 62 se redujeron reguladas. Diez puntos diferenciales eran comunes a las tres líneas celulares, incluyendo 6 hasta reguladas proteínas (β-actina, LDH, sistema antibloqueo de frenos, PRP19, ATP sintasa, y CAM) y 4 proteínas reguladas por (CLCP p64, RanGAP, P43 y calreticulina) , expresión y las 10 proteínas fueron verificados por Western blot en estas líneas celulares. Estas proteínas están implicadas en el metabolismo energético, la reorganización del esqueleto, el procesamiento de pre-ARNm, la transducción de señales, y otras proteínas estrechamente asociados con el desarrollo y progresión de muchos cánceres humanos [23,24]. Hemos detectado cuantitativamente la expresión de los genes que codifican estas 10 proteínas en tejidos de cáncer gástrico humano, el cual reveló que
β-actina
,
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
,
PRP19
y
CaM
fueron consistentemente altamente expresado y
RanGAP
se expresó mal en ambos tejidos de cáncer y /o ganglios linfáticos metastásicos en comparación con el tejido peri-cancerosos. La expresión aberrante de estas proteínas también se verificó por Western blot en el cáncer gástrico y los ganglios linfáticos metastásicos. A continuación, se encontró que los
cagA
+
H
.
pylori
colonizados en 20 de 30 tejidos de cáncer gástrico y promueven o inhiben la expresión de estos genes in vivo.
LDH y DLD están estrechamente correlacionados con el metabolismo energético. Trastorno de metabolismo de la energía se considera un factor importante para el desarrollo y progresión del cáncer. En contraste con las células normales, las células cancerosas presentan un aumento de la dependencia de la vía glucolítica con oxígeno suficiente, la glucólisis denomina aeróbica. Una gran cantidad de ácido pirúvico, un producto final de la vía, se convierte en ácido láctico por LDH, la promoción de la glicolítico vía y la energía metabolismo desequilibrio [25]. El ácido láctico también puede disminuir el pH del microentorno celular, lo que aumenta la respuesta neovascular a factores de angiogénesis para promover la metástasis de células tumorales [26,27]. De acuerdo con nuestros resultados,
LDH
fue altamente expresado en tejidos de cáncer en el 61,8% de los pacientes con cáncer gástrico; pacientes con sobreexpresión de LDH tenían una supervivencia más corta en comparación con los pacientes con baja expresión [28]. Kim
et al
. [29] observaron que
sistema antibloqueo de frenos
expresión aumenta con la progresión tumoral, lo que proporciona más energía para el crecimiento de las células tumorales. Por lo tanto, la alta expresión de LDH y de larga distancia es un factor crucial para el desarrollo y la progresión del cáncer gástrico, y
H
.
pylori
promueve la expresión de estos dos genes en tejidos de cáncer gástrico.
Beta-actina, un componente clave del citoesqueleto, mantiene la estructura, el movimiento y la división de las células en condiciones normales.
β-actina
se expresa de manera anormal en muchas enfermedades [30]. La proteína PRPF19 se cree que funciona en el empalme de pre-ARNm. Ubiquitinación de PRPF19 podría dar lugar a daños en el ADN y la reparación del ADN anormal es una causa importante de la tumorigénesis [31]. La calmodulina es una proteína de unión a calcio que regula muchas vías de señalización y por lo tanto participa en la proliferación celular, la mitosis y la transcripción de genes. La calmodulina promueve la proliferación celular en carcinomas hepáticos en combinación con PI3K y la transición de G1 a la fase S en combinación con la ciclina E [32]. Un inhibidor de células detenciones calmodulina en fase G1 para inhibir la división celular [33]. De acuerdo con estos resultados, se determinó que
H
.
pylori
pueden participar en el desarrollo del cáncer de los tejidos gástricos mediante la inducción de la alta expresión de estas tres proteínas.
Además, se observó la baja regulación de la
RanGAP
gen en tejidos de cáncer con
H
.
pylori
. RanGAP es una proteína GTPasa de la activación. Después de la hidrólisis de GTP a GDP por una GTPasa, RanGTP activo se convierte en RanGDP inactivo, lo que lleva al bloqueo de la señalización para inhibir la progresión del cáncer [34] de la célula. Del mismo modo, disminución de la actividad RanGAP inducida por ubiquitinación promueve el desarrollo del cáncer [35].
metilación del ADN puede inducir la expresión de gen anormal.
H
.
infección pylori
aumenta los niveles de metilación de algunos genes y los resultados en la carcinogénesis de la mucosa gástrica [36,37]. La metilación del ADN suele aparecer en las islas CpG de promotores de genes. Detectamos el estado de metilación de las islas CpG de estos genes en las líneas celulares construidas y determinamos que el
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
y
CaM
genes fueron desmetiló en el promotor -2325, -1885 y -276 sitios, respectivamente, y el
RanGAP
gen fue altamente metilados en el promotor -570 y -170 sitios, en consonancia con la alta expresión de la
LDH
,
sistema antibloqueo de frenos
y
CaM
genes y la baja expresión de la
RanGAP
génica en tejidos de cáncer gástrico con
cagA
+
H
.
pylori
infección.
En conclusión, estos resultados sugieren que
H
.
pylori
, a través de la translocación de CagA, puede inducir la metilación aberrante de estos genes para conducir a la expresión del gen disfuncional en tejidos de cáncer gástrico y las células. Nuestros resultados proporcionan una nueva comprensión de la patogénesis molecular del cáncer gástrico con
H
.
pylori
. Los estudios futuros explorarán los efectos de estos patrones de metilación alterados en la patogénesis del cáncer gástrico en muestras clínicas.
Reconocimientos
Agradecemos al Centro Chino de
Helicobacter pylori
Gestión cepa y Preservación de proporcionar
H
.
pylori
NCTC11637 y el Dr. Yang y Wu Wenxiu Jiahong para la asistencia técnica.