Extracto
maligno derrames pleurales (MPE) puede ser útil como un modelo para estudiar la progresión jerárquica de cáncer y /o heterogeneidad intratumoral . Para fortalecer el fundamento para el desarrollo de la MPE-modelo para estos fines, nos propusimos encontrar evidencia de la presencia de células madre del cáncer (CSC) en MPE y demostrar la capacidad de mantener la heterogeneidad intratumoral en cultivos MPE-primarios. Nuestros estudios muestran que
candidato
pulmonares CSC-expresión firmas (PTEN, Oct4, hTERT, Bmi1, EZH2 y SUZ12) son evidentes en sedimentos de células aisladas de MPE y MPE-citopatología también etiqueta
candidata
-CSC (CD44, CMET, MDR-1, ALDH) subpoblaciones. Por otra parte, en cultivos primarios que utilizan MPE como la fuente de las células tumorales y el microentorno del tumor (TME),
candidato
CSC se mantiene en el tiempo. Esto nos permite vivir-sort
candidato
CSC-fracciones de la mezcla MPE-tumor en la base de marcadores de superficie CD44, (c-MET, uPAR, MDR-1) o las diferencias en el metabolismo de xenobióticos (ALDH) . Así, las culturas MPE-primarias proporcionan una vía para extraer
candidato
poblaciones de CSC individuales (isogénicas) MPE-tumores. Esto nos permitirá comprobar si estas células pueden ser discriminados en bioensayos funcionales. la heterogeneidad del tumor en cultivos primarios MPE-se evidencia por inmunomarcación variables, las diferencias en la morfología de colonias, y las diferencias en las tasas de proliferación de las subpoblaciones de células. En conjunto, estos datos justifican el desarrollo continuo de la MPE-modelo para la investigación de la heterogeneidad intratumoral, interacciones tumor-TME, y la validación fenotípica de
candidato
pulmonar CSC, además de proporcionar orientación para el desarrollo preclínico de la terapéutica racional
Visto:. Basak SK, Veena MS, Oh S, G Huang, Srivatsan E, Huang M, et al. (2009) El derrame pleural maligno como un modelo para investigar la heterogeneidad intratumoral en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10.1371 /journal.pone.0005884
Editor: Mauricio Rojas, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de diciembre de 2008; Aceptado: 28 de abril de 2009; Publicado: 12 Junio, 2009
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. los fondos para el estudio de los Fondos de investigación Biomédica de Asuntos de Veteranos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de cáncer y mortalidad en el mundo. La terapia actual es relativamente ineficaz, y la tasa de supervivencia a los 5 años es de aproximadamente 15%. la heterogeneidad intratumoral posiblemente subyace a la resistencia de los cánceres de pulmón a las terapias actuales; por lo tanto, considerar la heterogeneidad intratumoral puede ser una clave importante para el desarrollo de estrategias exitosas de tratamiento para el cáncer de pulmón. Lamentablemente, los actuales modelos de cáncer de pulmón están limitados en su alcance para estudiar la heterogeneidad del tumor. derrame pleural maligno (MPE) ofrecen una oportunidad única para la cultura de una amplia variedad de células cancerosas de un solo individuo, con el fin de delimitar y caracterizar el rango de heterogeneidad intratumoral encuentran en el cáncer de pulmón avanzado.
La justificación de la elección el error máximo permitido, una etapa regional avanzado de cáncer de pulmón que augura un mal pronóstico, como un modelo para investigar la heterogeneidad intratumoral es doble. En primer lugar, un modelo evolutivo de la carcinogénesis predice que los estados de enfermedad avanzada tienen más probabilidad de representar heterogeneidad [1]. En segundo lugar, sobre la base de observaciones personales hechas durante varios años de estudio de MPE [2], [3], [4], [5], se sabía que los cultivos primarios derivados de MPE muestran inicialmente heterogeneidad cultura marcada en su camino hacia el establecimiento de cáncer morfológicamente homogénea líneas celulares. Sin embargo, no habíamos investigado previamente la base biológica o temporal de estas observaciones de forma prospectiva.
No hay formas establecidas a la cultura MPE con el objetivo de mantener la heterogeneidad intratumoral. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar un modelo de cultivo primario
de novo. Este modelo incorpora el componente MPE-líquido y células del estroma extraídos en un microambiente tumoral (TME) que simula estrechamente la
In situ
medio. Nuestros datos indican que la incorporación de estos elementos parece preservar la heterogeneidad del tumor. Desde heterogeneidad tumor puede surgir debido a una progresión jerárquica de epitelio transformado [6], [7], la hipótesis de que incluyen en la mezcla de células tumorales en MPE son células que pueden funcionar como células madre de cáncer o progenitoras. Este manuscrito ofrece una prueba de concepto que
candidato
CSC puede fraccionarse de MPE cultivos primarios. Esta evidencia justifica el desarrollo del modelo de error máximo permitido para el examen de la heterogeneidad intratumoral y el estudio de
candidato
CSC-fenotipos.
Materiales y Métodos
MPE aislamiento, procesamiento y cultura y
Todos los sujetos fueron sometidos consentimiento informado por escrito mediante un procedimiento aprobado por la junta de revisión institucional del Sistema de Salud de Asuntos-los Angeles y Veteranos (VAGLAHS). Todos los sujetos eran fumadores activos y veteranos o antiguos, y MPE-especímenes fueron adquiridos por grandes toracocentesis volumen. Las muestras se procesaron como se describe en la figura 1. Brevemente, después de la centrifugación (200 x g, 20 minutos, temperatura ambiente), los sedimentos celulares se resuspendieron en un gradiente de densidad de Ficoll. El MPE-sobrenadante se filtra de manera estéril y se utiliza para la formulación de la
p
rimary
c ultura
m edio
[PCM; DMEM-H (Hyclone, UT) + 30% v /v estérilmente filtrada componente MPE-líquido + penicilina-G /estreptomicina 1.000 U /ml y anfotericina B 0,25 g /ml (Omega Scientific, CA)]. La selección de la v /v fracción 30% del componente de MPE-líquido se deriva empíricamente. Debido a que los componentes solubles y /o celulares clave que contribuyen al mantenimiento de la heterogeneidad tumoral en cultivos MPE-primaria es (son) no se conoce, y puesto que no hay variabilidad-derrame a derrame en las concentraciones de factores solubles, la selección de 30 % v /v componente MPE-fluido se basa en la observación de cultivos primarios por microscopía de luz. Brevemente, monitorizamos tres errores máximos permitidos diferentes en cultivos primarios que contienen ya sea 100%, 70%, 50%, 30% y 10% de componente MPE-fluido. Se evaluó la integridad de la cultura y la variabilidad mediante microscopía, y se midieron las fracciones de células muertas flotantes (por tinción con azul tripán) en cada estado durante varios días. No hubo diferencias aparentes cualitativos en la integridad de la cultura o la variabilidad, y no hay diferencias cuantitativas en las células muertas flotando entre el 70%, 50% y 30% v /v condiciones MPE-fluido. Los 100% y 10% v /v MPE-condiciones tuvieron un aumento en la muerte celular en dos de cada tres derrames. Esta observación, junto con la consideración práctica de que el componente MPE-fluido fue
la Red factor limitante para la duración de la experimentación con cultivos primarios, nos llevó a utilizar el 30% v /v error máximo permitido en los casos restantes.
MPE se extrajo de la cavidad pleural de pacientes con cáncer de pulmón. El error máximo permitido recogida fue
sedimentado (200 × g)
y el
sedimento celular
fue separado del fluido de error máximo permitido. El sedimento celular se resuspendió en medio esencial mínimo que contiene MPE-líquido y en capas en un
Ficoll gradiente
. La fracción de células nucleadas, que era en gran parte desprovista de los eritrocitos en la mayoría de los casos, se recogió del interponga de gradiente de Ficoll y medio de suspensión, y se procesa para la tinción (
H & amp; E, IHC
),
análisis moleculares Opiniones y
cultura y primaria. Los cultivos primarios se mantienen en PCM, y se analizan más de
agar blando formación de colonias
,
FACS análisis
y
tumorigénesis in vivo en
.
para establecer cultivos primarios, el pellet de células nucleadas se extrajo a partir del gradiente de Ficoll, se lavaron con DMEM-H, y después se separaron alícuotas para su almacenamiento, análisis moleculares iniciales y citopatología, se sembraron varios cultivos primarios. Estos fueron observados directamente sobre una base diaria, y
pcm
fue reemplazado en cada 5-7 días. Los análisis cinéticos de crecimiento de los cultivos primarios se realizaron en tres muestras distintas MPE. Para estas determinaciones, los cultivos primarios se sembraron en paralelo en placas de 48 pocillos (Corning Incorporated, Nueva York), a una densidad de 2 × 10
4 células /pocillo en 500 l de medio de cultivo. Para contar, se recogieron las células flotantes primero en suspensión, después de lo cual las poblaciones adherentes se lavaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y separados (Tripsina-EDTA, Sigma MO). Después se añadieron las células desprendidas a la suspensión inicial de células, y las células vivas totales (Trypan azul colorante de exclusión) se contaron manualmente por hematocitómetro en puntos de tiempo designados. Este tipo de estudios son la base de los resultados informados de que las culturas MPE-primarios crecieron a tasas de crecimiento muy variables y lentos.
Los anticuerpos
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para inmunohistoquímica (IHC) y /o citometría de flujo (FACS ): anti-CD 44 (monoclonal de ratón, Abcam#16728 para IHC; ratón anti-CD44 humano IgG2b-FITC, BD Biosciences#555478 o PE-CD44 marcado con el ratón anti-humano, BD Pharmingen#555479 para FACS), anti-uPAR (monoclonal de ratón, Santa Cruz Biotechnology#sc-13522), anti-ALDH1A1 (monoclonal de conejo, Abcam#52492), anti-CD166 FITC (monoclonal de ratón; Abcam#33403); primario no marcado anti-CMET (IgG2a de ratón, Abcam#49210), sin etiqueta anti-MDR-1 (monoclonal de ratón, Chemicon#Mab4338) primaria, y anti-uPAR (Santa Cruz Biotech#13522). Los anticuerpos secundarios utilizados para el estudio: cabra F (ab ') 2 anti-ratón IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorios#M35018) y de cabra anti-ratón F (ab') 2 IgM (Jackson ImmunoResearch )
Citopatología y Immunolabeling
Los agregados celulares se examinaron utilizando microscopía de contraste de fase (Leica -. Leitz DMRBE) en portaobjetos de vidrio cubiertos, o por microscopía de luz después de la fijación y tinción. Para estos últimos, las células fijadas en etanol (Fischer Scientific, PA) o Z-fix (Anatech, MI) se sedimentaron para generar un botón de células, que se embebidos en parafina. Para IHC, secciones (5 micras) se deparaffinized y rehidratada en xileno y etanol. la recuperación de antígenos [ácido cítrico 10 mM (pH 6), 70 ° C, 30 min, dos veces con la intervención de lavado con agua) se llevó a cabo, después de lo cual los portaobjetos se enfriaron a temperatura ambiente y se lavaron secuencialmente con agua desionizada y PBS. La actividad peroxidasa endógena se inactivó (PBS + 2% de peróxido de hidrógeno), y las muestras fueron bloqueados secuencialmente [1% de albúmina de suero bovino /PBS, a temperatura ambiente 1 hora, seguido por suero de ratón (Santa Cruz Biotechnology) durante 30 min, temperatura ambiente] . a continuación, las secciones de tejido se lavaron dos veces con PBS, se incubaron con el anticuerpo secundario (conjugado con HRP de cabra anti ratón, Santa Cruz Biotechnology, 30 min, temperatura ambiente), se enjuagaron con PBS y se expusieron al kit de sustrato DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Los controles negativos utilizan típicamente el anticuerpo secundario solo, en ausencia de etiquetado con el primario. Se observaron las secciones teñidas con el microscopio (Leica - Leitz DMRBE o Olympus IX71) y las imágenes captadas se analizaron usando el software Openlab. Las áreas de células teñidas positivamente se estimaron utilizando software Image Pro Plus. grupos de células se definieron de forma manual utilizando imágenes de fase y la herramienta AOI irregular y los grupos resultantes fueron segmentado basado en un umbral determinado empíricamente tinción positiva. Porcentaje de células teñidas positivamente se estima con base en el área fraccional de tinción dentro del área total clúster.
La transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR)
ARN se extrajo de la MPE y cultivo primario aislados utilizando reactivo Trizol y Fast Track 2.0 kit de aislamiento de ARNm (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). 500 ng del mRNA fue a transcripción inversa utilizando el kit de RT (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Dos alícuota l del cDNA sintetizado se usó para la PCR para la amplificación de genes PTEN, Oct4, Bmi1, hTERT, SUZ12 y EZH2. Los cebadores utilizados fueron los siguientes:
PTEN
Delantero - 5 'GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3', inversa 5 'TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3',
Oct4
orientadas hacia el 5'CAACTCCGATGGGGC CCT 3 'y revertir -5 'CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3'
Bmi1
Delantero - 5 'AATCTAAGGAGGAGGTGA 3', 'CAAACAAGAAGAGGTGGA 3' reverse-5,
hTERT
Delantero -5 'GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3', inversa 5 'CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3',
SUZ12
Delantero - 5 'GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3' y revertir 5 '- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA - 3',
'TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3' EZH2
Delantero 5, Reverse 5 'TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3'. Para
PTEN
amplificación, las condiciones fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 4 minutos, seguido de 32 ciclos a 94 ° C for1 minutos, 57,5 ° C durante 1 minuto y 72 ° C durante 3 min. Una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos se utilizó. Las condiciones de amplificación para
Oct4
eran una desnaturalización inicial de 5 min a 95 ° C, seguido de 32 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos con una final extensión a 72 ° C durante 5 min. Las condiciones de amplificación para
Bmi1
: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 4 minutos seguido de 32 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 53 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, y una extensión final durante 7 minutos a 72 ° C. Para
hTERT
las condiciones de amplificación fueron: una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 4 min, seguido de 32 ciclos a 94 ° C durante 50 segundos, 52ºC durante 50 segundos, 72ºC durante 1 min, y una extensión final a 72 ° C durante 7 min. Para SUZ12 y EZH2 amplificación: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C para 30 segundos; 55 ° C durante 30 segundos; 72 ° C durante 30 s, y una extensión final de 7 minutos a 72 ° C. Los productos de PCR se separaron en 8% TBE (Tris 50 mM de borato de pH 8,0, EDTA 1 mM) seguido de tinción de geles de bromuro de etidio. Los geles fueron analizados utilizando el software Kodak 1D.
La citometría de flujo y Aldefluor ensayo
FACS análisis de MPE células de cultivo primario se realizó por análisis FACS mutichannel estándar usando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San José , CA) y el software de análisis de FCS Express (De Novo software, Ontario, Canadá). se recogieron y se combinaron las células Tanto no adherentes y adherentes. Las células en cultivo primario se separaron usando el tratamiento con tripsina /Versine, se lavó con PBS que contenía 2% de BSA, y directamente marcaron con anticuerpos primarios fluorocromo marcado, o anticuerpo primario no marcado con anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos (como se indica a continuación). Ambas concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios se mantuvieron constantemente a 1 g /1 x 10
6 células; las células se marcaron durante 45 minutos a temperatura ambiente y se lavó secuencialmente tres veces en PBS que contenía 2% de FBS, se resuspendieron en PBS y se mantuvieron en hielo antes de los análisis de FACS. El Aldefluor (Stemcell Technologies, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.) de ensayo, que mide la actividad de aldehído deshidrogenasa (ALDH), se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. MPE-células de cultivo primario se suspendieron en tampón de ensayo que contiene el Aldefluor ALDH-sustrato, Bodipy-aminoacetaldehído (BAAA; 1,5 mM) y se incubaron durante 50 min a temperatura ambiente. Para verificar la especificidad, un espécimen paralelo se incubó en condiciones idénticas, pero en presencia de un exceso molar de 10 veces de la ALDH-inhibidor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Esta disminución resultante de la intensidad de fluorescencia de las células ALDH-positivos se utilizó para compensar el citómetro de flujo análisis.
Resultados
MPE-características, procesamiento y cultivo primario
Para desarrollar un modelo para el estudio de cáncer de pulmón endofenotipos en cultivo primario, fraccionado de la célula y los compartimentos de líquidos de MPE (Figura 1). Las características clínicas de los derrames que se utilizaron para generar este conjunto de datos eran típicas de MPE (Tablas 1 y 2, véase más adelante). Siete de los nueve derrames eran maligna sobre la base del diagnóstico histopatológico (Tabla 1). En dos MPE, la interpretación citopatología final a partir de 100 ml del espécimen de la muestra fue "altamente sospechoso pero no concluyentes"; estos casos se incluyeron porque el crecimiento del tumor fue evidente en los cultivos primarios (incluyendo
in vivo
en un caso, los datos no presentados). Estudios anteriores habían indicado que a largo chapado eficiencias y derivación de cultivos primarios a partir de muestras clínicas de cáncer de pulmón es pobre y depende tanto de las condiciones de cultivo y los factores relacionados con el huésped [8], [9], [10], [11]. Sin embargo, esos estudios no complementan las culturas del tumor primario con los componentes de los
In situ
microambiente tumoral (TME), posiblemente debido a que el objetivo principal o única era establecer líneas de células tumorales inmortales. De hecho, con el fin de derivar líneas de células tumorales "pura" en condiciones definidas, todos los enfoques anteriores tomaron medidas para minimizar la "contaminación" de las culturas con TME-elementos. En consecuencia, si existían distintas subpoblaciones de células tumorales en tumores individuales que dependía de elementos de TME para la supervivencia, a continuación, utilizando cualquier TME artificial puede haber conferido una ventaja de crecimiento a subconjuntos específicos de células tumorales en un sistema de cultivo continuo. Por lo tanto, es posible que los modelos celulares de cáncer fueron "seleccionados por" la cultura de TME que se utilizó para derivar las líneas de células tumorales.
Estamos motivado que la dotación completa de endofenotipos de células tumorales sería mejor estudiado en cultivos primarios que incorporaron TME autólogo. Por lo tanto, en un intento de mantener la heterogeneidad intratumoral
ex vivo
, tanto de la población de células nucleadas-acompaña tumor y el componente de fluido de MPE fueron utilizados para enriquecer la cultura primaria-TME. Para superar la ineficiencia previamente reconocido para establecer cultivos de tumores primarios, y en base a observaciones empíricas que se describen en los métodos, hemos elegido la condición de "óptima" como siendo el 30% de MPE-fluido componente mezclado v /v en el medio de base que contiene antibióticos (medio de cultivo primaria o PCM). En
pcm
, tanto cultivo primario y pases seriados se mantuvieron con mayor diversidad en la morfología, y los cultivos parecía ser más robusta (en comparación con el crecimiento paralelo de suero bovino fetal, no se muestran datos). Por otra parte, la utilización de un 30% v /v-fracción de MPE-líquido nos permitió conservar este reactivo limitante para duraciones más largas de la experimentación con cultivos primarios. Utilizando esta metodología, se establecieron cultivos primarios de MPE-tumores de los siete intentos.
Análisis
preliminar indicó que el sobrenadante fue altamente enriquecido con citocinas inflamatorias, con concentraciones de interleuquina (IL) 1, IL-6, quimioquinas CXC ligando 10 (IP10), ligando de quimiocina CC 2 (MCP1), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se estima en & gt; 10 ng /ml. Estos y otros factores, lo que probablemente se originó a partir del tumor, estromales y /o células que circulan en MPE (Tabla 2), contribuyeron a una mezcla compleja de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento en el componente MPE-fluido. Con respecto a los celulares MPE-componentes, los recuentos de células nucleadas variaron de 1,3 × 10
8-2,5 × 10
9 células por litro de derrame. La circulación de tipo celular predominante en el TME eran linfocitos (media ± DesvEst: 60 ± 26% de total de 681 ± 560 WBC /l), con significativa (& gt; 1%) fracciones de PMN, macrófagos, monocitos y células mesoteliales (Tabla 2) en casi todos los derrames. Por lo tanto, en términos de su composición de células circulantes y bioquímica (todos ellos eran exudados) [12], los derrames que estudiamos eran típicas de error máximo permitido.
Las pruebas de heterogeneidad intratumoral en muestras tumorales extraídas MPE-
La figura 2A muestra representativa de H & amp; E citopatología con tinción de gradación de densidad de ficoll. Como se muestra, el tumor estaba contenida MPE forma variable dentro de los grupos indistintos de células de diferentes composiciones, o esferoides, así organizados. Un examen más detallado sugirió que ambos de estos conglomerados de células tumorales fueron ellos mismos organizados en microdominios distintas. Basamos esta sospecha en la observación de que cuando etiquetamos especímenes para
candidato
CSC-marcadores, a menudo nos encontramos dentro de la tinción de focos discretos en los agregados (Figura 2B). Por ejemplo, teñidas MPE muestras de patología para la expresión fraccionaria de CD44. CD44, el receptor de la superficie celular para el hialuronato de [13], se había utilizado como etiqueta de superficie para seleccionar CSC. CD44 fue utilizado anteriormente por sí sola [14] y en combinación con otros marcadores de superficie celular para ordenar CSC de diversos tumores malignos epiteliales, tanto en sistemas de modelos humanos y murinos [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21]. Todos los MPE especímenes muestran una fracción CD44 +, que osciló entre un 8% y el 47% de las células nucleadas por inmunohistoquímica (IHC) (Figura 2B, las figuras S1a y S1c). Además de CD44, fracciones celulares también muestran otra
candidato
CSC-marcadores, CMET [22], [23] y la MDR-1 [24], [25] (Figura 2B). Anteriormente y otros investigadores también han explotado en el metabolismo de xenobióticos de las células a segregar CSC de la mezcla del tumor. Una de tales técnicas utiliza el ensayo Aldefluor ™ (StemCell Technologies), que segregó
candidato
CSC sobre la base de la actividad ALDH1A1 [26], [27], [28]. Al igual que CD44, se encontró que las células que se observaron etiquetados para ALDH1 en los bolsillos agregados dentro de MPE-tumores (Figura 2B, Figura S1b). marcada variabilidad de la tinción fue evidente incluso dentro de un espécimen individual. Por lo tanto, se podría encontrar bolsillos discretos de débil, media y fuerte tinción ALDH1 (Figura 2B). Ante todo, estos datos indicaron que MPE especímenes individuales tenían diversos fenotipos inmunológicas y metabólicas. Por otra parte, si el
candidato
CD44 y ALDH-etiquetas eran marcadores sustitutos válidos para CSC, a continuación, CSC parecía residir en microdominios protegidas discretos (nichos) en las agrupaciones de MPE-tumorales. Por último, aunque la expresión temporal y correlación funcional de estos CSC-etiquetas aún no se ha determinado, los datos sugieren que las células que expresan
candidato
marcadores CSC podría ser potencialmente separa de la mezcla MPE-tumoral.
grupos (A) representativos de células y esferoides en MPE-citopatología. Representante H & amp; E de las muestras tumorales derivadas de MPE que muestran las agrupaciones y esferoides organizados de morfología variable, y las composiciones del estroma de células /(20 × 100 × o). (B) IHC para el candidato CSC marcador de expresión. especímenes tumorales derivadas de MPE fueron immunolabelled para
candidato
marcadores CSC, incluyendo CD44 (40 × 400 × y), CMET (100 × 400 × y), MDR-1 (100 × 400 × y), y ALDH -1 (40 × y 200 ×).
MPE-CSC-tumores expresan marcadores implicados en programas de expansión de células progenitoras o de pluripotencia
en general, los tumores surgen a causa de un paro anormal durante la diferenciación de tejidos [29], [30]. Una de las primeras manifestaciones de la diferenciación de detención es que hay una expansión de la fuente de células progenitoras. Por lo tanto, las firmas moleculares de las células progenitoras pueden servir como
candidato
CSC-biomarcadores. A este respecto, los estudios en animales han implicado PTEN para el mantenimiento y diferenciación apropiada de la población de células progenitoras de pulmón periférico [31]. PTEN silenciamiento promotor se evidencia en el cáncer de pulmón humano [32], que implican a esta vía en su desarrollo y /o progresión. La telomerasa activación (hTERT) contribuye a la patogénesis del cáncer de pulmón [33], y hTERT es comúnmente activa en el cáncer de pulmón. Junto con p16 (INK4A), hTERT parece ser necesario para la inmortalidad celular que caracteriza tanto las células madre y las células tumorales [34], y su expresión puede indicar un cambio dinámico en la fracción del fenotipo inmortalizado [35], [36]. marcadores entre
candidato compartidos
CSC y células madre también incluyen las vías que median células auto-renovación y pluripotencia. Oct4 es un marcador embrionario que se asocia con la pluripotencia, y se utiliza comúnmente para la etiqueta de la CSC-fenotipo [21], [37]. Del mismo modo, la regulación del estado pluripotente se epigenetically controlado por los cambios estructurales en la cromatina [38], [39], [40]. control de la transcripción durante el estado pluripotente es aplicada por el grupo Polycomb (PcG) de proteínas que trabajan para modificar la estructura de la cromatina. SUZ12, EZH2, y Bmi1 son componentes de los complejos de PcG y debido a que su expresión en el desarrollo es característica de las células madre de tejido, sino que también se han utilizado para etiquetar el
candidato
CSC-fenotipo [6], [7] , [41]. Para probar si estas señales moleculares de
candidato
CSC puede ser detectada en MPE-tumores, el ARN se extrae de las fracciones de células nucleadas y se realizó RT-PCR para estos marcadores. Se encontró que éstos
candidato
CSC-biomarcadores se expresaron en diferentes MPE-tumores (Figura 3). Estos datos sugirieron que el pulmón CSC-fenotipo se mantuvo en MPE a pesar del medio inflamatorio de la MPE-TME, al contrario de algunos postulados convencionales en relación con el medio ambiente nicho CSC. Tal vez, esto era debido a que el CSC fueron protegidos (como se describe) de la TME soluble en los conglomerados tumorales que sean verificadas en MPE. Más importante aún, estos resultados también establecen el escenario para el seguimiento dinámicamente estas señales moleculares como los cambios experimentales en las condiciones de cultivo se introducen en los esfuerzos para enriquecer la CSC-fenotipo.
Perfiles de expresión de PTEN, Oct4, hTERT, IMC1 , SUZ12, y EZH2 fueron estudiados por PCR de transcriptasa inversa. ARN extraído a partir del sedimento de células nucleadas de MPE se transcribió inversamente y el cDNA se utilizó en la amplificación por PCR de los respectivos genes. Los productos de PCR se separaron en 10% geles de TBE, seguido por tinción con bromuro de etidio, y se analizaron usando el software Kodak 1D. PTEN, hTERT, SUZ12, EZH2 se expresaron de manera uniforme en todo MPE, mientras BMI1 y expresión Oct4 no se detectó en muestras individuales. beta tubulina se utilizó como control de carga.
Las pruebas de heterogeneidad intratumoral en cultivos MPE-primaria
Se establecieron cultivos primarios de MPE-PCM. En estas condiciones, los cultivos primarios muestran diversas morfologías (Figura 4A), y las tasas de crecimiento de forma variable lentos. Los cultivos primarios normalmente tomó varias semanas para "madurar" (como se define por el crecimiento en el recipiente de cultivo se acerca el 70-80% de confluencia). Durante este intervalo, las agrupaciones y estructuras esferoidales que se observaron en el MPE-citopatología inicial no estaban bien conservadas. Sin embargo, los cultivos primarios muestran una heterogeneidad fenotípica que anteriormente no habían sido examinados. Durante su evolución, los cultivos primarios fueron siempre compuestas de colonias con diferentes morfologías (agregados flotantes que excluyen azul de tripano, las colonias de células gigantes, fibroblastoid y racimos de adoquines), a pesar de estar en el mismo matraz con una apariencia idéntica TME (Figura 4A). Estas colonias parecían expandirse a diferentes velocidades, lo que sugiere que tenían diferentes índices de proliferación, a pesar de estar en un entorno de "común". Razonó que si CSC, al igual que las células progenitoras de tejido, tuvo una facturación reducida, entonces las diferencias en la proliferación nos permitirían segregar fracciones enriquecidas para CSC. Para comprobar si una estrategia de este tipo era factible con MPE- cultivos primarios, hemos desarrollado una estrategia de clasificación de células vivas que utiliza carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) en un programa de ensayos de etiquetado para fraccionar las células sobre la base de diferentes índices de replicación. CFSE es un reactivo permeable de la membrana que se escinde por las esterasas intracelulares para producir un metabolito amino-reactivo fluorescente que permanece en el citoplasma por semana. Cada vez que las células se someten a la división, se redujo a la mitad la cantidad de CFSE presente en cada célula hija. Las células que no se replican conservan la etiqueta. Por lo tanto,
si
CSC están replicando lentamente,
a continuación
la retención de la etiqueta de la población debe ser enriquecido por CSC. A pesar de que los linajes celulares que componen la etiqueta de retención subconjunto necesitan ser más preciso, estos estudios piloto, la prueba de concepto sugirieron que el fraccionamiento MPE-tumoral en base a las diferencias en los índices de proliferación era factible (véase la etiqueta de retención de células población-M1 que surge con el tiempo en
pcm;
Figura 4B). En resumen, las diferencias en la morfología, proliferación, marcador de superficie y propiedades metabólicas posiblemente reflejan endofenotipos discretas de células cancerosas en MPE. Aunque las correlaciones funcionales asociados con cada una de estas características aún no han sido estudiarse más a fondo, nuestros resultados indican que en las culturas MPE-primaria, la investigación de la heterogeneidad intratumoral es factible.
(A) la heterogeneidad morfológica en cultivo primario. Tres MPE diferente (muestra A, muestra B y la Muestra C) se cultivaron en PCM se evaluaron para la morfología de las colonias. Cada columna (A, B, y C) representa una muestra distintas. se presentan fotomicrografías representativas de la heterogeneidad de colonias por microscopía de contraste de fase en los días 3, 15 y 20 del cultivo primario (filas 1, 2 y 3, respectivamente). Las fotomicrografías de las filas 1, 2 y 3 son a aumentos de 40 × 100 ×, y 400 ×, respectivamente. (B) MPE-subpoblaciones en cultivo primario se puede fraccionar sobre la base de diferencias en la proliferación: histogramas de flujo representativos de Día 1 Día frente a 9 de un cultivo primario marcado con CFSE. Con la expansión, las subpoblaciones que son proliferativa pierden la etiqueta CFSE, y los que son quiescentes conservan la etiqueta. En este ejemplo,
en el día 1, el 96,14% de los recuentos
se encuentran dentro de la región acotada por M1; en
día 9, 8,36% Red de los recuentos se encuentran dentro de la región acotada por M1.
racionalmente el fraccionamiento de las culturas MPE-primarias para ordenar la supuesta CSC-subpoblación
Con las firmas moleculares que sugieren que CSC están presentes en MPE, hemos probado próxima si pudiéramos capturar la em> candidata
CSC de MPE-tumores. En la maduración, MPE-primarias cultivos se clasifican sobre la base de
candidato
CSC-marcadores. Curiosamente, en cada caso probado hasta ahora, el inmunofenotipo superficie de las células en cultivo primario indicado en general una expansión aparente en la fracción CD44 + (Figura 5). Mientras que las células eran casi uniformemente positivo para la expresión CD44, fracciones fueron más variable positiva para cMet, CD166 [42], y uPAR [43] expresión (Figura 5). Además, usando un ensayo de fluorescencia que se informó para ordenar putativo CSC de cáncer de pulmón, cáncer de mama y mieloma múltiple [26], [27], [28] sobre la base de la actividad de ALDH diferencial, una pequeña fracción de la derivada de MPE tumores primarios muestran la ALDH
hi /CD44
+ fenotipo (Figura 6). En conjunto, estos datos indican que
candidato
CSC-fracciones podrían estar separados de los cultivos primarios de MPE-tumoral.