Extracto
El cisplatino (
cis
-diamminedichloroplatinum, CDDP) es un agente quimioterapéutico conocido para el el tratamiento de varios tipos de cáncer. Sin embargo, el mecanismo de apoptosis subyacente precisa de las células cancerosas inducida por CDDP sigue siendo poco clara. En este estudio, mostramos que mecánicamente CDDP induce la apoptosis mediada por GM3 de células HCT116 mediante la inhibición de la proliferación celular, y el aumento de señales de apoptosis mitocondrias dependiente de la fragmentación del ADN y. CDDP indujo apoptosis en las células a través de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), regula la expresión mediada por ROS de Bax, Bcl-2, y p53, y se indujo la degradación de la poli (ADP-ribosil) polimerasa (PARP). También se verificaron los niveles de expresión de los diferentes gangliósidos en células HCT116 en presencia o ausencia de CDDP. Curiosamente, entre los gangliósidos, CDDP aumentada la expresión de la sintasa de solamente GM3 y su producto GM3. Reducción del nivel sintasa GM3 través de la expresión ectópica de GM3 pequeños ARN de interferencia (siRNA) rescató HCT116 células de la apoptosis inducida por CDDP. Esto se evidencia por la inhibición de las señales de apoptosis mediante la reducción de la producción de ROS a través de la regulación de la actividad 12-lipoxigenasa. Además, la sensibilidad de apoptosis a CDDP se incrementó notablemente en las células HCT116 transfectadas sintasa-GM3 comparación con la de los controles. Además, las células transfectadas sintasa-GM3 tratados con CDDP mostraron un aumento de la acumulación intracelular de ROS. Estos resultados sugieren la apoptosis oxidativa inducida por CDDP de células HCT116 está mediada por GM3
Visto:. Chung T-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song K-H, Jin U-H, et al. (2014) El gangliósido GM3 se asocia a la apoptosis inducida por cisplatino en células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10.1371 /journal.pone.0092786
Editor: Rupesh Chaturvedi, Escuela de Medicina de la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2013; Aceptado: February 25, 2014; Publicado: 14 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Chung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente estudio ha sido apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias básicas través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvención financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (MEST) de Corea (NRF-2013R1A1A2005387) y el tumor personalizada concesión de Ingeniería Centro de Investigación (2008- 0.062.611). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cisplatino (
cis
-diamminedichloroplatinum, CDDP) es un agente quimioterapéutico usado comúnmente para el tratamiento de diversos tumores sólidos. CDDP se une al ADN para generar aductos de ADN [1]. Estudios anteriores han demostrado que CDDP regula la actividad de ciertos canales iónicos, proteínas de transporte y diversas enzimas de la membrana plasmática [2], [3], e induce especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la quimioterapia del cáncer [4]. En consecuencia, CDDP regula la reparación del ADN, la inhibición de la transcripción, la detención del ciclo celular y la apoptosis [5]. Se ha informado de que las quinasas extracelulares reguladas por señales (ERK), los c-Jun quinasas N-terminal (JNKs) /activada por estrés de la proteína quinasa (SAPK) y la p38 mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) se activan en CDDP apoptosis inducida de las células cancerosas [6], [7]. Además, CDDP induce apoptosis Fas /FasL mediada en células epiteliales humanas [8] y el daño mitocondrial mediante la regulación de los niveles de expresión de la familia Bcl-2, que tienen funciones ya sea pro- o anti-apoptóticos. Al afectar CDDP citotoxicidad en células de cáncer, la transactivación mediada por p53 de la pro-apoptótica Bax, disminución de Bcl-2 expresión y la escisión de la subasta conduce a una reducción en el potencial mitocondrial y aumenta la degradación de PARP mediada por caspasa mediante la liberación de citocromo c de la mitocondria [9] - [12]. Varios estudios han informado que estos fenómenos apoptóticos se deben a la alteración de la composición de la membrana [13]. Entre los componentes de la membrana, se ha informado de que los niveles de expresión de gangliósidos se alteran en las células cancerosas tratadas con fármacos [14].
Los racimos de glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico (GSL) son ubicuos en la microdominios de membrana en todo células de mamíferos y están implicados en una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo las interacciones célula-célula y de transducción de señales [15]. Muchos estudios han informado de que los gangliósidos específicos, tales como GM3, GD3, GD1b y inducen la apoptosis en varios tipos de células [16], [17]. tratamiento GM3 en glial proliferación inmaduras y células neuronales resultados en la supresión de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis [18], [19]. Además, GM3 está involucrado en la muerte celular a través de la acumulación de ROS y la entrada de iones de calcio intracelular en las células neuronales [20], [21]. En las células de cáncer de vejiga murino, GM3 sobreexpresión induce la apoptosis y reduce el potencial maligno [22]. En el presente estudio, se investigó la importancia funcional de gangliósido GM3 en células de cáncer colorrectal tratados con CDDP.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
El cáncer de colon humano línea celular HCT116 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; JBI, Daegu, Corea) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C bajo 5% de CO
2. El cisplatino se adquirió de Dong-A CO farmacéutica., LTD (Seúl, Corea).
N
-acetil-
L-cisteína (NAC) se obtuvo de Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Baicaleína fue de Sigma-Aldrich. Los anticuerpos se obtuvieron como sigue: Anti-poli (ADP-ribosil) polimerasa (PARP), BCL-2, Bax y p53 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-gliceraldehído-3-phosphode-hidrogenasa (GAPDH) se adquirió de Chemicon (Temecula, LA). Anti-GM3 (M2590) se adquirió de Biotest Laboratories (Japón).
inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total de cada célula fue aislado utilizando el reactivo Trizol ( Invitrogen). Un microgramo de RNA se sometió a transcripción con oligo dT utilizando AccuPower RT premezcla (Bioneer Co., Daejon, Corea) inversa, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cDNA se amplificó por PCR con los siguientes cebadores utilizando EF-Taq polimerasa (SolGent, Seúl, Corea): GM3 sintasa (413 pb), 5'-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 '(sentido) y 5'-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3' (antisentido ); GD3 sintasa (460 pb), 5'-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 '(sentido) y 5'-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3' (antisentido) GalNAc-T (GM2 /GD2 sintasa) (230 pb), 5'-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 '( sentido) y 5 'GATCATAACGGAGGAAGGTC-3' (antisentido); β-actina (247 pb), 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 '(sentido) y 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' (antisentido). El uso de cantidades iguales de ARNm en el ensayo de RT-PCR se confirmó mediante el análisis de los niveles de expresión de β-actina. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel en agarosa que contiene bromuro de etidio-1,5% con 0,5 ×-Tris-acetato EDTA (TAE).
viabilidad de las células de ensayo
La proliferación celular se investigó usando una comercialmente disponible kit proliferación II (XTT; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Brevemente, las células se subcultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 103 células /pocillo en 100 l de DMEM /10% de FBS. Después de 24 h de incubación, el medio se desechó y se reemplazó con 100 l de medio fresco que contenía varias concentraciones de CDDP. Las placas se incubaron a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2 durante 12 h. Al final de la incubación, 50 l de la solución de ensayo XTT se preparó mezclando 5 ml de reactivo XTT-etiquetado y 100 l de reactivo de acoplamiento de electrones, que se añadió a cada pocillo. Después de 4 h de incubación a 37 ° C y en condiciones de CO2 5%, se midió la absorbancia usando un lector de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de ensayo de 490 nm.
Flow estimación de citometría de intracelulares
estado redox producción
ROS se evaluó por tinción de las células con diacetato de dichlorodihydrofluorescein (H
2DCFDA; Molecular Probes, Carlsbad, CA). Las células se lavaron dos veces con DMEM que contiene 10% de FBS, se incubó en 10 mM H
2DCFDA diluido en DMEM durante 20 min a 37 ° C, se lavaron con PBS, y se trataron con tripsina. células disociadas se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, se resuspendieron en PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).
Western blot
Las células se homogeneizaron en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 150 mM, 0,02% NaN
3, 100 mg /ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mg /ml de aprotinina, y 1% de Triton X- 100. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). Treinta microgramos de lisado celular total se fraccionó por tamaños por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema Hoefer electrotransferencia (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Para detectar las proteínas diana, se incubaron las membranas con los respectivos anticuerpos. La detección se realizó utilizando anticuerpos de rábano secundaria peroxidasa ligada anti-ratón y anti-conejo (Santa Cruz), y el sistema de quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences).
La sobreexpresión de gangliósido GM3 sintetasa y su producto en las células HCT116
Para construir el plásmido de expresión GM3 sintasa, un fragmento de ADN de 1,1 kb que incluye la región humana sintasa GM3 de codificación se amplificó por PCR utilizando oligonucleótidos cebadores 5'-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 '(sentido), 5' ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3 '(antisentido) y ADNc de cerebro fetal humano como una plantilla. Los cebadores sentido y antisentido contienen
Hind III y
Eco RI
sitios de restricción (subrayado), respectivamente. El fragmento fue purificado de un gel de agarosa al 1% usando el SV Gel y Asistente Sistema de PCR Clean-Up (Promega) y se digirió con la enzima de restricción apropiada, y se ligaron utilizando T4 ligasa (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) en un pcDNA3 vector, para generar pcDNA-GM3. Para identificar el constructo con el gen de la sintasa de GM3, mapeo de restricción y secuenciación de ADN se llevaron a cabo. HCT116 células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células fueron transfectadas con 1 g de pcDNA y el plásmido pcDNA-GM3 por el método WelFect-EX ™ PLUS (JBI). Después de la incubación, las células transfectadas se cultivaron en presencia de 500 mg /ml de G418 (Life Technologies, Inc.). Después de 21 días en el medio selectivo, se aislaron colonias resistentes a G418 individuales. Tres clones positivos que expresan GM3 sintasa a niveles altos, como se determina por RT-PCR, se utilizaron para el análisis adicional.
Ensayo de la luciferasa
plásmidos reportero, pGL3-1600 se prepararon mediante la inserción de la
Sac
/
Bgl II
fragmentos de la cada uno de los plásmidos generados anteriormente [23] en los sitios correspondientes del vector de luciferasa sin promotor pGL3-Basic (Promega). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células fueron co-transfectadas con 0,5 pmol de GM3 sintasa construcciones indicadoras de promotor-luciferasa y 0,5 g de β-galactosidasa plásmido por el método de WelFect-EX ™ PLUS (JBI). Las células fueron cultivadas en medio que contiene 10% de FBS y se incubaron con CDDP durante 12 h. La actividad de luciferasa y la actividad β-galactosidasa se analizaron utilizando el sistema de ensayo de enzima luciferasa y β-galactosidasa (Promega). La actividad de luciferasa se normalizó a la actividad β-galactosidasa en el lisado celular y el promedio se calculó sobre la base de tres experimentos independientes.
La inmunofluorescencia
células de cáncer de colon HCT116 se sembraron a una sub-confluente densidad en 12 mm- diámetro cubreobjetos estériles en placas de cultivo tisular de seis pocillos. Las células se fijaron en 3,7% de formaldehído /PBS y se lavaron tres veces con PBS y después se permeabilizaron en 0,5% de Tween-20 /PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Los sitios no específicos se bloquearon con PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. A partir de entonces, una solución de GM3 (M2590), GD3 o anticuerpos GM2-específicos se inundaron más de las células a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con PBS, las células se incubaron adicionalmente con FITC conjugado anti-IgM de ratón durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de lavado con PBS, y finalmente montados en el reactivo anti-fade (Molecular Probes), que contiene 4 ', 6-iamidino- 2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se analizaron mediante un microscopio de fluorescencia Nikon (Nikon, Japón). El anticuerpo secundario pre-absorción solo también se incluyó como control negativo para el experimento.
fragmentación del ADN de ensayo
Se recogieron las células cultivadas, se lavaron con PBS, se lisaron en tampón (Tris 10 mM -HCl (pH 7,4), EDTA 10 mM, 0,5% de Triton X-100), y se incubó en hielo durante 10 min. Las muestras se centrifugaron a 4 ° C durante 10 min, y los sobrenadantes se incubaron con 200 mg /ml de RNasa A a 37 ° C durante 1 h. Posteriormente, las muestras se incubaron con 200 mg /ml de proteasa K en 50 ° C durante 30 min. Después de la precipitación con isopropanol, el ADN se resuspendió en una solución de Tris-EDTA. Las muestras se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio y transiluminación UV.
análisis citométrico de flujo de células apoptóticas
Para identificar las células apoptóticas, pcDNA- o pcDNA-GM3 células HCT116 -transfectaed se trataron con CDDP durante 24 h. Las muestras se lavaron con PBS, se tiñeron con 1 mg /ml de FITC-anexina V (BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente y se analizaron por citometría de flujo utilizando un instrumento FACS Calibur (Becton-Dickinson )
análisis HPTLC de gangliósidos
Los gangliósidos a partir de células de cáncer de colon humanas tratadas con o sin CDDP (1,5 × 10
7 células) se extrajeron con cloroformo:. metanol: agua (2: 1:0.4, v /v /v), y se fraccionaron y se analizaron por HPTLC usando gel de sílice de 60 placas (Merck). Las placas se revelaron con cloroformo: metanol: 0,2% CaCl acuosa
2 (55:45:10, v /v /v). Los gangliósidos se visualizaron mediante pulverización de la placa con el reactivo resorcinol hidrocloruro.
Preparación y transfección de ARN pequeños de interferencia (siRNAs)
Un dúplex siRNA diseñado para atacar la secuencia codificante de mRNA sintasa humana y GM3 un ARNm de proteína de la planta de clorofila /unión b-como control negativo se sintetizaron por Bioneer Corporation. Las secuencias diana para siRNAs sintasa GM3 son 5'-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 ', 5'-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3', y 5'-CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 '. células de cáncer de colon HCT116 fueron transfectadas con siRNAs sintasa GM3 y siRNA control negativo, respectivamente, mediante el uso de WelFect-EX ™ PLUS (JBI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, complejos de transfección se retiraron y se reemplazaron con medio de cultivo. Después de incubar con CDDP en medio de cultivo durante 24 h, se utilizaron las células transfectadas para su posterior análisis.
Resultados
CDDP induce la apoptosis a través de la acumulación de ROS
Para determinar el capacidad de CDDP para inducir la apoptosis en las células HCT116, las células se trataron con varias concentraciones de CDDP durante 24 h y el ADN aislado de las células HCT116 tratados con CDDP se resolvieron mediante electroforesis. Como se muestra en la Fig. 1, CDDP indujo fragmentación del ADN. También se examinó el efecto de CDDP en las señales de apoptosis dependiente de mitocondrias y la expresión de p53 durante la apoptosis inducida por CDDP. El tratamiento de células HCT116 con CDDP dio como resultado el aumento de la p53 y la expresión de Bax, así como la reducción de Bcl-2 expresión. Además, el tratamiento CDDP dio como resultado el aumento de escisión de PARP, lo que indica activación de la caspasa mediante la liberación de citocromo c a través de la reducción del potencial de membrana mitocondrial (Fig. 1B). Como la generación de ROS se ha informado a desempeñar un papel importante en la citotoxicidad inducida por CDDP [24], se evaluó el efecto del tratamiento CDDP sobre el estado redox intracelular de células HCT116. Se comparó la producción de ROS en las células tratadas con CDDP a que en las células no tratadas CDDP por análisis de citometría de flujo utilizando H
2DCFDA. Como se muestra en la Fig. producción 1C, ROS se incrementó en las células tratadas en comparación con CDDP- CDDP- células no tratadas. Sin embargo, el tratamiento concomitante con NAC, un inhibidor de la ROS, junto con CDDP reduce la acumulación de ROS intracelular (Fig. 1C). Correlacionada con la capacidad inhibidora para inducir ROS, NAC también fue capaz de inhibir de manera significativa las señales de muerte celular en presencia de CDDP, como se evidencia por transferencia de Western. Como se muestra en la Fig. 1D, CDDP indujo la expresión de las proteínas apoptóticas Bax y p53, así como la escisión de PARP inducida y la reducción de la expresión de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2. Estos efectos de CDDP sobre las células de cáncer de colon humano fueron bloqueados por NAC. Estos resultados indican que se requiere la generación de ROS por CDDP para la apoptosis de las células HCT116.
(A) Después del tratamiento de CDDP en las concentraciones indicadas durante 24 h, se aisló el ADN genómico y se separó por electroforesis en un 2% gel de agarosa. El ADN se tiñó con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. (B) La proteína total a partir de células HCT116 fue aislado, y el análisis de inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos indicados. células HCT116 (C) se trataron con o sin 30 mg /ml de CDDP después de pre-tratamiento con NAC 10 nM, seguido de la sustitución del medio de cultivo con medio recién preparado que contiene 10 mM DCFH-DA. Después de 30 min de incubación a 37 ° C, la intensidad de fluorescencia se midió por citometría de flujo. Los resultados representan el aumento veces a partir de sus respectivos controles (células no tratadas con CDDP), considerado como 1. Los datos representan la media ± SD de 3 mediciones independientes.
*** P & lt; 0,001 vs. el control tratado con CDDP. (D) las células HCT116 se trataron con o sin CDDP (30 mg /ml) después de pre-tratamiento de la NAC (10 nM). La proteína se aísla de las células y se analizaron por inmunotransferencia utilizando anticuerpos indicados. GAPDH se incluyó como un control interno.
CDDP aumenta gangliósido GM3 en células de cáncer de colon
han informado de estudios anteriores que la apoptosis celular se produce por la alteración de la composición de la membrana [13], [14] .We examinó si CDDP en las células HCT116 regula los niveles de expresión de GM2 y GD3 sintasa genes y los gangliósidos GM2 y de GD3, pero no hubo cambios tanto en los parámetros de la expresión génica (datos no presentados) y la producción de gangliósidos (Fig . 2D). CDDP aumentó la expresión de la sintasa de GM3 sólo en las células HCT116 de CDDP inducida (Fig. 2A). Además de esto, también se investigó si CDDP induce la expresión de la sintasa de GM3 utilizando otras células de cáncer de colon tales como DLD-1, LoVo y WiDr. tratamiento CDDP dio como resultado la expresión mejorada de GM3 sintasa en otras líneas celulares de cáncer de colon humano (datos no mostrados). Además, investigó si la expresión de GM3 sintasa en el modelo actual de las células HCT116 de cáncer de colon humano es inducida por el uso de otros agentes quimioterapéuticos (5-fluorouracilo y doxorrubicina), que son bien conocidos para inducir la apoptosis de diversas células cancerosas humanas así como células de cáncer de colon. La expresión de GM3 sintasa no fue inducida por ambos agentes anti-cáncer (datos no mostrados). Como se muestra en la Fig. 2A, los niveles de mRNA de GM3 sintasa se incrementaron en las células HCT116 inducidas por CDDP, como se evidencia por RT-PCR. Además, se investigó si la actividad del promotor del gen de la sintasa de GM3 se estimula en células HCT116 inducidas por CDDP. Recientemente, se ha informado de la regulación de la transcripción CREB mediada por el GM3 sintasa de genes humanos [23]. Por lo tanto, para determinar GM3 gen de la sintasa actividad promotora por CDDP, GM3 promotor del gen sintasa (pGL3-1600), CREB mutación del promotor GM3 sintasa (pGL3-1600 CREB Mu) y los plásmidos pGL3-básicos se transfectaron en células HCT116 con, o sin CDDP , respectivamente, seguido de la medición de la actividad de luciferasa usando un ensayo de indicador. Como se muestra en la Fig. 1B, la actividad transcripcional de pGL3-1600 en las células HCT116 tratadas con CDDP era significativamente mayor que en las células de control no tratadas y en las células HCT116 pGL3-Basic-transfectadas con o sin tratamiento CDDP. Como era de esperar, la actividad transcripcional de la mutante CREB marcadamente disminuido en alrededor de dos veces en comparación con el promotor pGL3-1600 en las células HCT116 tratadas con CDDP. Además, como se muestra en la Fig. 2C, un aumento en la producción de gangliósido GM3 se observó en HCT1116 células inducidas por CDDP, como se evidencia por el ensayo de inmunofluorescencia. actividad de inmunofluorescencia de GM3 en las células tratadas con CDDP se convirtió en altamente detectable de una manera dependiente de la dosis, mientras que en las células no tratadas no se detectó, mediante M2590 como un anticuerpo monoclonal-GM3 específico y el anticuerpo secundario como un control negativo, respectivamente. Por otra parte, se investigó patrones de gangliósidos en las células HCT116 tratadas con y sin CDDP utilizando el análisis HPTLC. Curiosamente, entre los gangliósidos, gangliósido GM3 se incrementó notablemente en las células HCT116 tratadas con CDDP comparó el control CDDP (Fig. 2D). Estos resultados muestran claramente que tanto la expresión sintasa GM3 y gangliósido GM3 producción se incrementan en las células HCT116 tratadas con CDDP
.
(A) ARN total a partir de células HCT116 se aisló después del tratamiento con las concentraciones indicadas de tratamiento CDDP para 12 h y GM3 sintasa mRNA se detectó mediante RT-PCR. (B) las células HCT116 se transfectaron transitoriamente con el promotor de gen de la sintasa GM3 (pGL3-1600) y la mutación de CREB promotor GM3 sintasa (pGL3-1600 CREB Mu), y después se cultivaron con o sin CDDP durante 12 h. La actividad de luciferasa se determinó a partir de lisados de células como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados mostrados son medias ± SD de tres experimentos independientes con medición por triplicado.
*** P & lt; 0,001 vs. el control tratado con CDDP. (C) las células HCT116 se cultivaron y a continuación se incubaron con la concentración indicada de tratamiento CDDP durante 12 h. se detectó inmunorreactividad contra el gangliósido GM3 usando un isotiocianato de fluoresceína (FITC) de cabra conjugado con anti-IgM de ratón sin o con el anticuerpo M2590. (D) Los gangliósidos aisladas de las células HCT116 tratados con CDDP (0, 10 y 30 mg /ml) se analizaron mediante HPTLC.
El descenso de regulación del gangliósido GM3 por siRNA dirigidos GM3 sintasa protege apoptosis de las células por CDDP
Nuestros datos anteriores mostraron que CDDP induce apoptosis a través de eventos de señal de la producción de ROS, y la expresión del gangliósido GM3 sintetasa y su producto GM3 mejorada. Por lo tanto, para determinar si el aumento de GM3 gangliósidos en células HCT116 tratados con CDDP se asoció con la apoptosis mediada por CDDP, hemos diseñado tres siRNAs dirigidos específicamente contra GM3 sintasa (siGM3). No. 2 y 3, pero no No. 1 de tres siGM3 claramente la expresión de la sintasa de GM3 el regulado en las células HCT116 tratadas con CDDP, como se determina por análisis de RT-PCR (Fig. 3A). Además, siGM3 2 y 3, pero no 1 (Fig. 3B) restauró patrones de expresión de Bax, Bcl-2 y p53 en las células tratadas con CDDP a los de las células no inducidas CDDP. Estos resultados sugieren que se requiere la regulación de GM3 para la apoptosis de las células HCT116 inducidas por CDDP.
HCT116 células fueron transfectadas con siRNA dirigidos a tres GM3 y el control negativo siRNA. Las células fueron cultivadas durante 12 (30 mg /ml). Total de ARN y proteínas lisados de las células se prepararon como se describe en Materiales y Métodos. (A) Los niveles de mRNA GM3 sintasa en ARN total obtenidos a partir de cada célula se detectó mediante RT-PCR. (B) La proteína total se preparó a partir de las células y se analizaron por transferencia Western usando los anticuerpos indicados.
La mejora de gangliósido GM3 en las células HCT116 tratadas con CDDP regula 12-lipoxigenasa de activación (12-LOX) para ROS producción
muerte de células nerviosas inducida por los resultados de glutamato en la producción de ROS por medio de la activación de 12-LOX, y localización inducida de 12-LOX a la membrana, que está relacionada con la activación de la 12-LOX [25]. Nuestros colegas han informado de que el 12-LOX es reclutado para glicoesfingolıpido enriquecidos con microdominios (GEM) en un gangliósido GM3 manera dependiente de la toxicidad del glutamato durante oxidativo [21]. Nuestros datos muestran que CDDP induce señales de apoptosis dependiente de mitocondrias a través de la generación de ROS mediada por GM3 gangliósidos en células HCT116 (Fig. 3 y Fig. 4A). Por lo tanto, se investigó si un inhibidor específico de la 12-LOX, baicaleína inhibe la actividad de 12-LOX para la producción de ROS en células HCT116 que expresan el gangliósido GM3 inducida por CDDP. Como se muestra en la Fig. 4B, CDDP indujo la expresión sintasa GM3 y la producción de ROS. Sin embargo, baicaleína suprime la producción de ROS estimulada por CDDP, aunque la expresión GM3 sintasa inducida por CDDP no estaba regulado por baicaleína. Además, el NAC ROS scavenger, inhibe la generación de ROS, pero no sintasa GM3 en las células HCT116 tratados con CDDP. Estos resultados sugieren que gangliósido inducida por CDDP expresión GM3 puede regular la actividad de 12-LOX para la producción de ROS mediante la contratación 12-LOX a GEM.
Células HCT116
(A) fueron transfectadas con siRNA dirigidos GM3 y el control negativo siRNA. Las células fueron cultivadas durante 12 h en presencia o ausencia de CDDP (30 mg /ml). El medio de cultivo se sustituyó con medio recién preparado que contiene 10 mM DCFH-DA. Después de 30 min de incubación a 37 ° C, la intensidad de fluorescencia se midió por citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 mediciones independientes.
** P & lt; 0,01 y
*** P & lt; 0,001 vs. el control tratado con CDDP. ns: no tiene importancia. Para RT-PCR, ARN y proteínas totales lisados de las células se prepararon como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de mRNA GM3 sintasa en ARN total obtenidos a partir de cada célula fueron detectados por RT-PCR. (B) las células HCT116 se trataron con o sin 30 mg /ml de CDDP después de pre-tratamiento de 10 nM o NAC 1 M baicaleína, y luego el medio de cultivo fue reemplazado con medio recién preparado que contiene 10 mM DCFH-DA. Después de 30 min de incubación a 37 ° C, la intensidad de fluorescencia se midió por citometría de flujo. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 mediciones independientes.
*** P & lt; 0,001 vs. el control tratado con CDDP. Para RT-PCR, ARN y proteínas totales lisados de las células se prepararon como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de mRNA GM3 sintasa en ARN total obtenidos a partir de cada célula fueron detectados por RT-PCR.
apoptosis inducida por CDDP es mayor en las células HCT116 que sobreexpresan GM3 sintasa
Para examinar la sensibilidad de la apoptosis mediada por CDDP entre las células HCT116 y células HCT116 que sobreexpresan GM3 sintasa, se generaron transfectantes estables que expresan GM3. El vector de expresión pcDNA3-GM3 que alberga el humano GM3 sintasa cDNA (HCT116 /GM3) y pcDNA3 vector vacío (mock) se transfectaron en células HCT116. Después de la selección de colonias resistentes a G418, se confirmó que la expresión de GM3 mRNA sintasa y gangliósido GM3 fueron altamente expresado en las células HCT116 /GM3 comparación con las células transfectadas de manera simulada, como se evidencia por RT-PCR y ensayo de inmunofluorescencia (Fig. 5A). Estos resultados muestran que la sintasa enzimáticamente activa GM3 se sintetiza en las células HCT116 /GM3. En condiciones de cultivo normales (10% de FBS), la tasa de crecimiento de las células GM3 HCT116 /no fue diferente en comparación con las células control, y los cambios en las señales de apoptosis no se observaron en estas células, como se evidencia por análisis de transferencia Western (datos no presentados). Sin embargo, cuando estos transfectantes fueron tratados con CDDP en una forma dependiente de la dosis, un mayor número de las células disociadas de la placa en HCT116 /GM3 comparación con las células simuladas tratados con 30 mg /ml de CDDP. De hecho, se demostró que las células HCT116 /GM3 a ser más sensibles a CDDP que las células simuladas en la inhibición del crecimiento celular como se evidencia por el ensayo de XTT (Fig. 5B). Además, se observó un incremento en el daño al ADN después de la exposición CDDP en HCT116 /células GM3 comparación con las células tratadas de forma simulada usando un ensayo de fragmentación del ADN (Fig. 5C). Desde Anexina V tiñe la fosfatidilserina tirón hacia fuera en el lado exterior de la membrana plasmática, volteando de la fosfatidilserina desde el lado interior al lado exterior de la membrana plasmática se sabe que es una de las características de las células apoptóticas. En el presente estudio, como se muestra en la Fig. 5D, las células positivas anexina V medido por citometría de flujo también se incrementaron significativamente en las células HCT116 /GM3 tratados con CDDP en comparación con las células simuladas. Para investigar el mecanismo molecular que subyace al efecto sensibilizador de GM3 en la citotoxicidad inducida por CDDP, la degradación de PARP mediada por caspasa por reducción del potencial mitocondrial se examinó después del tratamiento CDDP en diversas concentraciones (Fig. 5E). El análisis de transferencia Western mostró que en las células /GM3 HCT116 el nivel de la escisión de PARP se aumentó en comparación con las células simuladas. Estos resultados sugieren que GM3 sensibiliza a las células HCT116 a la apoptosis inducida por CDDP. Nuestros resultados muestran que ROS juega un papel central en las células HCT116 inducidas por CDDP, que lleva a apoptosis de las células. Se comparó la producción de ROS en células HCT116 /GM3 a que en las células simuladas por análisis de citometría de flujo utilizando H
2DCFDA. Como se muestra en la Fig. 5F, la producción de ROS inducida por CDDP se aumentó en HCT116 /células GM3 comparación con las células simuladas, pero no en las células pretratadas-NAC, lo que indica que se requiere un aumento en los niveles de GM3 para la producción de ROS en la apoptosis inducida por CDDP de células HCT116. Estos datos indican que la producción de ROS depende de los niveles GM3 en células HCT116 inducidas por CDDP.
(A) RT-PCR y ensayo de inmunofluorescencia confirmaron la expresión de la sintasa de GM3 y su producto de GM3 en un transfectante estable de pcDNA- GM3 en células HCT116. Como control, el vector solo (pcDNA) HCT116 transfectadas no expresó GM3. , vector (pcDNA3) HCT116 células transfectadas /células transfectadas con pcDNA3-GM3 GM3, simulacros. viabilidad (B) de la célula se evaluó 24 h después del tratamiento CDDP a las concentraciones indicadas usando el ensayo de XTT en HCT116 /células GM3 comparación con las células tratadas de forma simulada. Los datos son medias ± SD de tres experimentos independientes. (C) Después del tratamiento de CDDP en las concentraciones indicadas durante 24 h, se analizó el ADN genómico en un gel de agarosa al 2%. (D) poblaciones de células apoptóticas se midieron por análisis de FACS Calibur empleo de Anexina V-tinción como se describe en los Materiales y Métodos. Las flechas indican las poblaciones de apoptosis en las células HCT116 simuladas y /GM3, respectivamente. (E) HCT116 /GM3 o células simuladas fueron tratados con indicado las concentraciones de CDDP durante 12 h. lisados de células enteras y medio sobrenadante se prepararon y se analizaron por inmunotransferencia como se describe en Materiales y Métodos, utilizando los anticuerpos indicados. (F) El efecto del tratamiento CDDP se midió en la distribución de la fluorescencia de la oxidación DCFH en HCT116 /GM3 o células simuladas. Rubin et al. Como se muestra en la Fig. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.