Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) se asocia con factores de estilo de vida que afectan a la señalización de insulina /IGF, de los cuales la insulina sustrato receptor 1 (IRS1) es un transductor clave. Hemos investigado la expresión, localización y correlaciones patológicas de IRS1 en el epitelio del colon cáncer no afectado, CRC primarias con metástasis hepáticas pareadas y
in vitro
polarizar células Caco2 y HT29. IRS1 ARNm y proteínas resultaron superiores, en relación con la mucosa emparejado, en los adenomas de pacientes con poliposis adenomatosa familiar y en los CRC que sobreexpresan
c-MYC
, ß-catenina, InsRß, y IGF1R. Análisis de IRS1 inmunotinción en 24 casos de CCR primaria con epitelio del colon emparejado y la metástasis hepática mostró que intensidad de la tinción fue significativamente mayor en las metástasis en relación tanto CRC primaria (
P
& lt; 0,01) y el epitelio del colon (
P
& lt; 0,01). CRCs primarios y metastásicos, en comparación con el epitelio colónico, contenían un número significativamente mayor de células IRS1 positivos (
P
= 0,013 y
P
= 0,014, respectivamente). correlaciones patológicas en 163 CRC primarias reveló que la tinción difusa IRS1 se asoció con tumores que combinan fenotipo diferenciado y marcadores agresivos (alta Ki67, p53, y ß-catenina). En Caco 2 IRS1 y InsR se expresaron como máximo después de la polarización, mientras que IGF1R fue mayor en las células pre-polarizado. No se detectó IRS1 nuclear, mientras que, con la polarización, IRS1 fosforilada (pIRS1) desplaza de la lateral a la membrana plasmática apical y se expresó en células de la superficie solamente. En HT29, que llevan mutaciones constitutivamente activar la señalización de supervivencia, IRS1 y IGF1R disminuyeron con la polarización, mientras que pIRS1 localiza en puntos nucleares en todo el curso. En general, estos datos proporcionan evidencia de que IRS1 se modula según la diferenciación de CRC, y apoyan un papel de IRS1 en el CCR progresión y el hígado metastatización
Visto:. Esposito DL, Aru F, R Lattanzio, Morgano A, M Abbondanza , Malekzadeh R, et al. (2012) El receptor de insulina sustrato 1 (IRS1) en epitelial intestinal y la diferenciación en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (4): e36190. doi: 10.1371 /journal.pone.0036190
Editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Noviembre 2010; Aceptado: April 1, 2012; Publicado: 27 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Esposito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (http://www.airc.it/), IG 9168 (2009); Ministerio Italiano de Investigaciones Científicas (http://www.istruzione.it/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) se ha relacionado con factores de riesgo del estilo de vida, sobre todo las dietas basadas en alimentos y de alta densidad energética baja actividad física [1] - [3]. Epidemiológica y evidencias experimentales indican que la hormona insulina y los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) papel clave 1 y 2 juego (s) en la mediación del efecto complejo (s) de la dieta y el ejercicio sobre el riesgo de CCR [4] - [10] . La sobreexpresión del receptor de insulina (InsR) y del receptor de IGF1 estrechamente relacionados (IGF1R) es crítica para el sistema de la insulina /IGF sobreactivación en el cáncer [4], [7], [9]. epitelio intestinal, que posee una de las tasas de renovación más altos entre los tejidos humanos, expresa tanto la InsR y la IGF1R, y los niveles de estos receptores son más altos en CRC con respecto a la mucosa del colon [4], [7], [8], [ ,,,0],11].
intestinal la diferenciación del epitelio está regulado por varias vías, la señalización de Wnt especialmente ß-catenina que dependen de [12], [13]. La mayoría de los CRC aparecen después de iniciar la inactivación de las mutaciones en la poliposis adenomatosa coli (
APC
) gen, que codifica un componente central del complejo citosólico multi-proteína que controla la degradación de ß-catenina [14] - [16].
APC
células -mutated muestran una alta ß-catenina citoplasmática y nuclear; este último, después de unirse a la TCF /LEF factores de transcripción, que forma complejos, mediante el encendido de varios genes relacionados con el cáncer, imponen un fenotipo progenitor cripta proliferativa (revisada por lo http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html ) [17].
Curiosamente, evidencias recientes vinculan la ß-catenina y la insulina /IGF vías de señalización. De hecho,
IRS1
, que codifica uno de los dos principales sustratos del receptor de insulina (IRS1 y IRS2), que integran señalización de la InsR, IGF1R y otras citocinas y receptores de factores de crecimiento [18], está altamente regulada al alza en las células con exógenamente inducida o constitutiva ß-catenina de señalización [19]. Esto parece depender de la regulación directa de
IRS1 fotos: por complejos /LEF-ß-catenina TVC. Además, IRS1 es necesario para la transformación en las células que expresan ectópica oncogénico ß-catenina y para mantenimiento del fenotipo neoplásico en
APC
-mutated células [19]. Estos resultados son consistentes con la evidencia anterior que IRS1 ectópico promueve la transformación, mientras que un dominante negativo
IRS1
mutantes actúa como un supresor de tumores [20]. Por otra parte, en el
Apc gratis (
Min
/+) modelo de ratón, la tumorigénesis intestinal es atenuada por
IRS1
knock-out [21].
en el presente estudio se determinó la expresión, localización y correlaciones clínico-patológicas de IRS1
ex vivo, en el epitelio cáncer de colon humano no afectado, CRC primarios y metástasis hepáticas pareadas, y
in vitro
, en dos modelos de células capaces de CRC espontánea
in vitro
polarización, Caco2 y HT29 [22], [23].
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
a, (FFPE) serie incluido en parafina y fijado en formalina de 24 CRC primarias con la mucosa colónica cáncer no involucrado emparejado y la metástasis hepáticas sincrónicas se identificó retrospectivamente en el Departamento de Ciencias quirúrgicas y oncológicas, Universidad de Palermo, Palermo, Italia. Para esta serie se utilizaron secciones enteras estándar para inmunohistoquímica (IHC). Una serie FFPE adicional, que consiste solamente en los CRC primarias, proporcionada por el Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas (DDRC), la Universidad de Teherán de Ciencias Médicas de Teherán, Irán, incluidos 163 de los 205 casos de CCR descritos en Bishehsari et al. y en Mahdavinia et al. [24], [25], seleccionados en base a la disponibilidad de tejido. Estos CRC se habían caracterizado previamente para el estado de inestabilidad de microsatélites (MSI) y
p53 Opiniones y
KRAS
mutaciones [24], [25]. los datos clínico-patológicas, incluyendo la edad y el sexo, el tamaño del tumor, estadio y grado, estaban disponibles para todos los 163 pacientes. No se dispuso de seguimiento y la supervivencia de datos. microarrays de tejidos (TMA) se construyeron mediante la extracción confirmado histológicamente núcleos CRC a partir de bloques de donantes con un conjunto Beecher MTA-2 mm Punch (Instrumentos Beecher, Sun Prairie, WI, EE.UU.). Los núcleos fueron re-incrustados en bloques de parafina y las secciones cuadriculadas estándar TMA se utilizaron para IHC.
Las muestras de tumor y la mucosa del colon emparejado, congeladas instantáneamente o rápidamente fijo en RNAlater (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA), se recogieron en el Departamento de Fisiopatología clínica, Universidad de Florencia, Florencia, Italia, a partir de 8 casos de CCR no seleccionados y 2 poliposis adenomatosa (FAP) de los pacientes con familiares de la línea germinal-molecularmente identificado
APC
mutación (respectivamente Glu1309fsX1312 y Ser843fsX860). Recogida y análisis de muestras y datos clínico-patológicas fueron aprobados por el
G. D'Annunzio
Comité de Ética de la Universidad y por la Junta de Revisión Institucional de la DDRC, Shariati Hospital de la Universidad de Teherán (protocolo de fecha 17/03/2004). Se anónimos todos los casos.
IHC
TMA y las secciones de tejido toda estándar se redujeron a 4 micras y se tiñeron con anticuerpo policlonal de conejo anti-IRS1 (C-20, sc-559, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) a una dilución 1:300 durante 30 min, después de la recuperación de antígeno mediante tratamiento de microondas a 750 W durante 10 min en tampón de 10 mM citrato de sodio pH 6,0 (Dako, Glostrup, Dinamarca). Se utilizó el kit EnVision anti-conejo (K4003, Dako) para la amplificación de la señal. secciones de serie TMA también se incubaron con los siguientes anticuerpos monoclonales de ratón: anti-ß-catenina (17C2, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, Reino Unido), anti-p53 (DO7, Novocastra) y anti-Ki67 (MIB-1, Dako), para los que la recuperación de antígeno se llevó a cabo por baño termostático a 96 ° C durante 40 min en tampón de citrato de sodio (Dako), y anti-EGFR pharmDx (2-18C9, Dako), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los inmunorreacciones fueron revelados por un sistema de peroxidasa de estreptavidina-biotina-mejorado (Sistema de Super Sensitive Link-Label IHC detección, BioGenex, Milán, Italia). Los controles positivos y negativos se incluyeron para cada anticuerpo y en cada lote de tinción.
Para cada marcador de los porcentajes de células positivas se estimaron en cuatro campos a 400 × magnificación (≈1000 células). IRS1, Ki67, p53, EGFR y ß-catenina se consideraron positivas cuando & gt; 1% de las células tumorales se tiñeron, ß-catenina se obtuvo por separado para la inmunotinción en el citoplasma, núcleo y a lo largo de la membrana celular. Se utilizó la muestras independientes t-test para evaluar las diferencias en la expresión IRS1 (% de células positivas) de acuerdo con las características patológicas y mutaciones. Expresión de IRS1 se correlacionó con la de cada uno de los otros marcadores de prueba rho de Spearman. Se utilizó el programa SPSS (versión 15.0) (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) para todos los análisis estadísticos. Todos los citados valores de
P ¿Cuáles son las dos caras;
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
La densidad de IRS1 inmunotinción en el epitelio del colon cáncer no involucrado emparejado, primaria CRC metástasis de hígado y se determinó mediante análisis digital semicuantitativa utilizando el software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/). Las imágenes fueron adquiridas con los ajustes de campo brillante estandarizados (400 aumentos). Las imágenes JPEG de color capturados fueron convertidos a escala de grises las imágenes de 8 bits, a continuación, la función de gestor región de interés se utilizó para delinear áreas citoplasmáticos, que comprenden cada una de 5-15 células. elementos nucleares o estroma no deseados fueron editadas a cabo. Las áreas analizadas en 4 conjuntos emparejados de epitelio de las criptas, primaria CRC y la metástasis de hígado fueron un 11 por epitelio de las criptas inferior, 10 para la parte superior del epitelio cripta, 78 de epitelio del colon total, el 84 por CRC primaria, y el 84 por CCR metastásico. Uso de los parámetros predeterminados ImageJ, las unidades de medida para cada zona eran valor de densidad, área total de píxeles cuadrados, tamaño medio y fracción de área. Los valores de densidad de epitelio de las criptas, CRC CRC primario y metastásico, normalizado por tamaños de área, se analizaron mediante la prueba t de Student para datos independientes. Un valor de
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa [26]
Cuantitativo en tiempo real PCR (RTqPCR)
El ARN total de la mucosa emparejado y muestras de CRC fue. aislada con QIAzol (QIAGEN, Hilden, Alemania), se trató con ADNasa-1 (Ambion), comprobado mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa, y retro-transcrito con la alta capacidad de ADN Archivo Kit (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del fabricante. ensayos RTqPCR se realizaron por duplicado usando placas de 96 pocillos de reacción ópticas y una máquina ABI 7500HT (Applied Biosystems). trazan valores de amplificación de referencia se establecen de forma automática y umbrales se mantuvieron constantes para obtener tiempos de ciclo normalizado y los datos de regresión lineal. La mezcla de reacción por pocillo contenía 10 l de energía Syber Green (Applied Biosystems), 2,4 l de cebadores (concentración final 150 nM), 4,6 l de agua libre de ARNasa, cDNA 3 l (60 ng). Para todos los experimentos el protocolo de PCR fue: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y a 60 ° C durante 60 seg. La cuantificación se realizó en relación con
La ciclofilina
[27] utilizando el método ΔΔCT. cebadores Validado RTqPCR, diseñados con el software Primer Express 3.0, fueron:
La ciclofilina
, FW 5'TTTCATCTGCACTGCCAAGA3 '; RV5'TTGCAAAACACCACATGCT3 ';
IRS1
, 'RV5'GGAGAAAGTCTCGGAGCTATGC3' FW 5'GCAACCAGAGTGCCAAAGTGA3;
c-MYC
, FW5'CCACCACCAGCAGCGACT3 ', RV5'CAGAAACAACATCGATTTCTTCCTC3'.
Los cultivos de células
La modulación de IRS1 y del eje de insulina /IGF-1 se investigó en el Caco- 2 y líneas de células HT29 de CRC, que, en condiciones de cultivo específicas, se someten espontánea
in vitro
diferenciación [22], [28], [29]. Caco-2, desarrollado a partir de un CRC primaria extirpado de un 72 años de edad caucásico masculino, es MSI-estable y lleva una inactivación
APC
mutación puntual, con el segundo golpe por la pérdida de heterocigosidad (LOH), una mutación sin sentido en
ß-catenina
exón 5 (lo que no parece afectar a la degradación), y es de tipo salvaje para
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
y
PTEN
[23], [30] - [32]. HT29, desarrollado a partir de un CRC primaria extirpado de un 44 años de edad caucásico femenino, también es MSI-estable y lleva doble inactivación de golpear
APC
mutaciones (que aún permiten la fosforilación de ß-catenina limitado y ubiquitinación), así como mutaciones en
SMAD4
,
BRAF
,
TP53
, y
PI3KCA
, que codifica la subunidad catalítica p110α de la clase I fosfatidilinositol 3-quinasas ( PI3K) [23], [31] (véase también el Catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer, http://www.sanger.ac.uk/cosmic).
células Caco-2 y HT29 se obtuvieron a partir ATCC (ATCC-LGC Promochem, Londres, Reino Unido). células Caco-2 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) bajo una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C. Las células se sembraron en 10 cm placas de Petri y se dejaron crecer a confluencia. Tras la confluencia (designado como punto de tiempo cero) Caco-2 de cultivo se lleva a cabo en DMEM con 20% de FBS. Todo el curso del tiempo se realizó dos veces y se obtuvieron lisados de células enteras a los 3, 7 y 14 días desde la confluencia. Se mantuvieron las células HT29 en DMEM con 10% de FBS y se dejaron crecer durante 3 (preconfluentes), 7 (confluente) y 14 (post-confluentes) días, a la que veces se obtuvieron lisados de células enteras.
Western Blot
células enteras o lisados de tejido se prepararon usando tampón de lisis enfriado en hielo (NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, 1% Triton X-100, 50 mM Hepes pH 7,9, 10 mM NaF, pirofosfato de sodio 4 mM, Na3VO4 mM 2) suplementado con inhibidores de proteasa (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 2 mg /ml de aprotinina, 2 mg /ml de leupeptina). Los lisados se aclararon por centrifugación (10.000 xg durante 20 min) y el contenido de proteína se determinó por el método de Bradford. Cincuenta microgramos (50 mg) de proteínas totales se resolvieron en condiciones reductoras en 7,5% SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa reforzada. La membrana se bloqueó con leche en polvo 3% no grasa en PBS con 0,01% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente y después se incubó durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: policlonal de conejo anti-IRS1 (C-20, Santa Cruz), diluido 1:500; IRS1 anti-tirosina 632 fosforilados-(pIRS1 Tyr632) anticuerpo policlonal (Santa Cruz), diluido 1:200; anti-ß-catenina monoclonal (Ylem, Roma, Italia), diluido 1:50 o policlonal anti-ß-catenina (# 9