Extracto
Antecedentes
El número de pacientes con carcinoma de endometrio (EMCA ) con estadio avanzado o de alto grado histológico es cada vez mayor y el pronóstico no ha mejorado nada para en la última década. Hay una necesidad urgente para el descubrimiento de nuevas dianas moleculares para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la EMCA, que tienen el potencial de mejorar la estrategia clínica y pronóstico de esta enfermedad.
Metodología y Resultados
Se utilizó un enfoque de la proteómica "drill-down" para facilitar la identificación de nuevas dianas moleculares para el diagnóstico, pronóstico y /o intervención terapéutica para la EMCA. Sobre la base de iones de péptidos identificados y sus tiempos de retención en el primer análisis LC-MS /MS, una lista de exclusión se generó para las siguientes iteraciones. Un total de 1529 proteínas han sido identificados por debajo del umbral de error Proteinpilot® 5% a partir de los siete conjuntos de experimentos iTRAQ realizadas. En promedio, la segunda iteración añadió 78% de nuevos péptidos a los identificados después de la primera carrera, mientras que la tercera iteración añadió 36% péptidos adicionales. De las proteínas identificadas 1529, sólo el 40 satisfacen nuestros criterios para la expresión diferencial significativo en EMCA en comparación con los tejidos proliferativos normales. Estas proteínas incluyen enzimas metabólicas (piruvato quinasa M2 y lactato deshidrogenasa A); proteínas de calcio de unión (S100A6, calcyphosine y Calumenin), y proteínas implicadas en la regulación de la inflamación, la proliferación y la invasión (la anexina A1, interleuquina factor de unión potenciador 3, alfa-1-antitripsina, proteína de la limitación de los macrófagos y la catepsina B). Los análisis de la red reveló la regulación de estas dianas moleculares por c-myc, Her2 /neu y TNF alfa, lo que sugiere la intervención con estas vías puede ser una estrategia prometedora para el desarrollo de nuevas terapias moleculares dirigidas para la EMCA.
Conclusiones
Nuestros análisis revelaron la importancia de enfoque de la proteómica drill-down en combinación con iTRAQ a superar algunas de las limitaciones de las estrategias proteómicas actuales. Este estudio condujo a la identificación de una serie de nuevas dianas moleculares que tienen potencial terapéutico para las terapias moleculares dirigidas para el carcinoma de endometrio
Visto:. Voisin SN, Krakovska O, Matta A, DeSouza LV, Romaschin AD, Colgan TJ, et al. (2011) La identificación de nuevas dianas moleculares para el cáncer endometrial usando un enfoque de LC-MS /MS Profundización con iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10.1371 /journal.pone.0016352
Editor: Yang Cai, El Instituto de Investigación de la Infancia, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Agosto, 2010; Aceptado 20 de diciembre de 2010; Publicado: 31 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Voisin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La ayuda de la Sociedad del cáncer del Instituto de Investigación de Canadá (anteriormente el Instituto Nacional del cáncer de Canadá) se agradece. AB Sciex proporcionó apoyo infraestructural y el reactivo de esta investigación; Ajay Matta es el beneficiario de una beca de MITACS Accelerate, Ontario, Canadá. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. AB Sciex proporciona apoyo de infraestructura y el reactivo de esta investigación, pero no tiene ninguna contribución editorial en este manuscrito. Además, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El carcinoma de endometrio (EMCA) es el cuarto cáncer más frecuente en las mujeres, en América del Norte, con 42160 casos nuevos y muertes por 7780 espera que este año sólo en los EE.UU. [1]. Hay dos tipos principales de cáncer de endometrio: Tipo I EMCA de la histología endometrioide y Tipo II EMCA que es célula seroso o claro en la morfología, el último tipo normalmente siendo el más agresivo de los dos. EMCA tipo I es la forma más común de cáncer de endometrio, que constituyen aproximadamente el 70-80% del total de casos [2], [3]. El diagnóstico se basa principalmente en el examen histológico de los tejidos obtenidos después de una biopsia, un procedimiento invasivo realiza típicamente como resultado del diagnóstico de investigación sobre sangrado uterino anormal en la presentación. carcinomas de endometrio se han tratado principalmente por medio de la cirugía con radiación adicional y /o quimioterapia, y los resultados relativamente favorables se han alcanzado siempre que los cánceres se detectan a tiempo. Sin embargo, el número de pacientes con EMCA en una etapa avanzada o de alto grado histológico, lo cual es indicativo de un mal pronóstico, está aumentando [2], [4]. Hay una necesidad urgente para el descubrimiento de nuevas dianas moleculares para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la EMCA, que tienen el potencial de mejorar la estrategia clínica y pronóstico de esta enfermedad.
Recientemente, ha sido intensa interés en el estudio de la expresión de la proteína global y enfoques proteómicos parecen presentar una nueva estrategia para la investigación del cáncer y la identificación de nuevos biomarcadores para la aplicación clínica. Numerosos estudios proteómicos llevadas a cabo en los últimos años han intentado descubrir potenciales biomarcadores de cáncer a través de diferencial de proteínas de detección sistemática mediante cáncer y tejidos no cancerosos [5] - [9]. Una de las tecnologías más ampliamente utilizados para el descubrimiento de biomarcadores es un enfoque de abajo arriba que implica etiquetado química de péptidos resultantes de la digestión enzimática de proteínas de la muestra, seguido por la mezcla de las muestras de control y de prueba antes de la cromatografía en tándem líquido espectrometría de masas (LC- MS /MS) análisis para garantizar un tratamiento idéntico de las muestras [6], [7], [9]. Entre los más comunes de estos reactivos de marcado en uso actualmente son las etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) [10]. Tagging permite distinguir de péptidos por lo demás idénticas procedentes de muestras individuales en la mezcla a través de reportero de iones formados a partir de estas etiquetas, que permiten la cuantificación relativa del péptido dado en las muestras, y por lo tanto la proteína correspondiente. Debido a la complejidad de las muestras de tejido, un pre-fraccionamiento de las muestras usando intercambio catiónico fuerte (SCX) se realiza típicamente, antes de la separación analítica en una columna de nanoescala de fase inversa (RP), que está acoplado en línea con el espectrómetro de masas. A pesar de esta separación cromatográfica de dos dimensiones, todavía hay una tendencia a que un gran número de péptidos para co-eluyen durante la separación RP debido a la complejidad de la muestra. Como resultado, el espectrómetro de masas es típicamente sólo es capaz de examinar una fracción de los péptidos debido a limitaciones de tiempo. En una adquisición automática de datos, el software MS tiende a favorecer el análisis de los péptidos más abundantes a expensas de co-elución péptidos de menor abundancia. Como muchas proteínas cancerosas relevantes, incluida la señalización y proteínas reguladoras, se expresan típicamente en concentraciones bajas, esto de abajo hacia arriba, escopeta enfoque tiende a perder la oportunidad de adquirir la información más valiosa-[11]. Una posible solución a este problema es un análisis iterativo de la misma muestra, junto con una lista de exclusión de los péptidos identificados que se genera después de cada carrera y se utilizan para informar a la elección de los iones que son objeto de análisis por MS /MS durante las ejecuciones posteriores. Esta estrategia hace que el espectrómetro de masas para dirigirse a nuevos péptidos, menos abundantes para el análisis MS /MS durante cada iteración sucesiva. Las variaciones de este enfoque han sido reportados por láser de desorción /ionización asistida por matriz (MALDI) MS /MS y ESI-MS /MS [12], [13].
En el estudio, se utilizó un análisis iterativo , en lo sucesivo como el "enfoque de profundizar", para facilitar la identificación de nuevas dianas moleculares para el diagnóstico, pronóstico y /o intervención terapéutica para el cáncer de endometrio. El principal objetivo de este método es de drill-down para desenterrar más péptidos. Después del primer análisis LC-MS /MS, se añadieron los iones de péptidos identificados y su tiempo de retención para generar una lista de exclusión para más iteraciones en el análisis de LC-MS /MS. Nuestro enfoque es conceptualmente similar al método (sel-PIE) descrito anteriormente por Wang
y otros, "la exclusión selectiva de iones precursores".
[11]. A nuestro entender, esta es la primera vez que tal combinación de cuantificación de proteínas mediante el etiquetado y iTRAQ enfoque de análisis iterativo se ha utilizado para el descubrimiento de biomarcadores de cáncer.
Resultados
Identificación de proteínas utilizando iterativo el análisis con iTRAQ
un total de 1529 proteínas han sido identificados por Proteinpilot® a un nivel de confianza del 95% a partir de los siete conjuntos de experimentos iTRAQ llevadas a cabo en este estudio. La primera ejecución de todas las fracciones identificó un total de 1137 proteínas no redundantes, con el segundo y tercer iteraciones que contribuyen los restantes 392 proteínas no redundantes. En promedio, la segunda iteración añadió 78% de nuevos péptidos a los identificados después de la primera carrera, mientras que la tercera iteración añadió 36% más péptidos como se muestra en la Figura 1 y en la Tabla 1. Dentro de un conjunto dado, aproximadamente el 12% de los péptidos eran comunes a cualquiera de los dos iteraciones sucesivas; sin embargo, sólo 3-6% de los péptidos se identificaron en las tres iteraciones. Como era de esperar, estos péptidos adicionales mejoran la cobertura de las proteínas identificadas. De hecho, la segunda iteración añadió 34% de nuevas proteínas en promedio, mientras que la tercera iteración añadió sólo el 14% de la lista combinada de iteraciones 1 y 2; por lo tanto había poco incentivo para realizar más iteraciones. 40% de las proteínas identificadas durante la primera ejecución también se identificaron en los próximos dos iteraciones (Tabla 1). De los 1529 proteínas, 623 fueron identificados por un único péptido; 423 de los cuales mostraron ≥99% de confianza. Los restantes 906 proteínas se identificaron en promedio con seis péptidos por proteína, teniendo en cuenta sólo los péptidos con puntuaciones de confianza ≥95%. De los 1529 proteínas identificadas en este estudio, 1260 proteínas (es decir, 82%) tuvieron relaciones de iTRAQ reportados para muestras de tejido EMCA. Una lista completa de las proteínas identificadas y sus relaciones medias iTRAQ está disponible en la Tabla S1. Un gráfico de sectores que muestra la distribución de las funciones celulares de estas proteínas se muestra en la Figura 2.
En promedio, la segunda iteración añadió 78% de nuevos péptidos a los identificados después de la primera carrera, mientras que la tercera iteración añadió 36% más péptidos. Dentro de un conjunto dado, aproximadamente el 12% de los péptidos eran comunes a las dos iteraciones sucesivas; Sin embargo, sólo el 3 y el 6% de los péptidos fueron identificados en las tres iteraciones.
Identificación de proteínas expresadas diferencialmente en EMCA
Para determinar proteínas expresadas diferencialmente que pueden servir como dianas moleculares potenciales para la evaluación de diagnóstico y /o pronóstico de EMCA, todas las proteínas (n = 1529) identificado en este estudio se evaluó mediante los criterios descritos en el material & amp; sección de métodos. Se muestra una lista de las 40 proteínas que pueden servir como biomarcadores potenciales para EMCA en la Tabla 2. De estos 40 candidatos de biomarcadores, 38 fueron identificados con un mínimo de dos péptidos. Las dos excepciones (S100 calcio vinculante A6 proteínas y beta-2-glicoproteína 1) se incluyen porque fueron identificados por un péptido con ≥99% en la confianza, y la inspección manual mostraron una excelente calidad espectral de MS /MS (figuras S1 y S2) . iTRAQ valores individuales para la cuantificación de proteínas se enumeran en la Tabla S2a; una lista de todos los péptidos identificados con un nivel de confianza Proteinpilot ≥95% está disponible en el cuadro S3. Tabla S4 se enumeran las iteraciones en el análisis de la muestra donde se cuantificaron las proteínas en la Tabla 2. A medida que se obtuvieron de la EMCA y tejidos proliferativos normales de diferentes individuos y eran, por lo tanto, no son idénticas (es decir, los análisis no se replica), el concepto típico de desviación estándar en el análisis cuantitativo puede ser engañosa como medida de la calidad analítica. Tenemos, por lo tanto, optó por expresar las distribuciones de la variabilidad analítica e individual combinado de la siguiente manera: en nuestros análisis, el 28% de los valores iTRAQ individuales se desvían dentro de ± 10% de sus medios, el 54% dentro de ± 20% y el 88% dentro de ± 50% (véase la Tabla S2b para más detalles). Estas distribuciones son en apoyo de nuestra hipótesis de que un cambio del 50% de los ratios de iTRAQ es indicativa de la expresión diferencial. De hecho, hemos identificado un grupo de 16 proteínas adicionales que no alcanzaron el límite de nuestros criterios para la expresión diferencial y que todavía puede calificar después de la inclusión de muestras adicionales (Tabla 3).
Evaluación de potencial diagnóstico de las proteínas expresadas diferencialmente en EMCA
también se evaluaron otros parámetros relevantes para los potenciales de diagnóstico. Estos incluyen los valores predictivos positivos (VPP) y las áreas bajo la curva (AUC) disponibles de características operativas del receptor (ROC análisis). Los valores de los biomarcadores candidatos individuales se enumeran en la Tabla 2.
Verificación de la expresión diferencial de proteínas en los tejidos EMCA
La sobreexpresión de biomarcadores candidatos seleccionados: catepsina B, Calumenin, S100A6, lactato deshidrogenasa A (LDHA), y en los tejidos hnRNPA1 EMCA fueron verificadas por análisis de Western blot en un subconjunto de las mismas muestras de tejido utilizadas para iTRAQ LC-MS /MS. La Figura 3 muestra una comparación de cuatro tejidos EMCA (T) con cuatro endometria normales (N) para los cinco candidatos de biomarcadores con β-actina que sirven como control de carga. Además, los análisis de inmunohistoquímica en un conjunto independiente de muestras de tejido (n = 5 cada uno) reveló citoplásmica intensa y /o inmunotinción nuclear de la proteína S100A6 en las células tumorales de endometrioides secciones de tejido EMCA (resultados típicos se muestran en la Figura 4), mientras que no inmunotinción significativa se observó en las células epiteliales del endometrio proliferativos normales.
cantidades iguales de proteínas (50 g /carril) se resolvieron en 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS) en gel de poliacrilamida y luego electro-transferido sobre polivinilideno-difluoruro (PVDF) membrana. Después del bloqueo, las transferencias se incubaron con el anticuerpo monoclonal respectivo ratón en diluciones apropiadas a 4 ° C O /N. Las membranas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario. Las bandas de proteínas se detectaron mediante el método de quimioluminiscencia (GE Health Care) de Kodak Hyperfilm. El análisis de transferencia Western mostró más de expresión de (i) S100A6, (ii) Calumenin, (iii) la catepsina B, (iv) lactato deshidrogenasa A (LDHA), y (v) proteína heterogénea A1 (hnRNPA1) en tejidos de cáncer de endometrio (T1, T2, T3 y T4) en comparación con endometrio normal (N1, N2, N3 y N4). β-actina sirvió como control de carga que muestra la misma cantidad de proteína en cada carril.
El análisis inmunohistoquímico de la proteína S100A6 se llevó a cabo en secciones de tejido incluidas en parafina independientes de cáncer de endometrio y de endometrio normal (n = 5 cada uno) como se describe en Materiales y Métodos. Panel muestra (a) no inmunotinción de la proteína S100A6 en el endometrio normal; (B) el cáncer de endometrio que muestra la expresión citoplasmática de la proteína S100A6; y (c) control negativo sin mostrar expresión de la proteína S100A6.
Análisis de Redes
Se realizó el análisis Ingenuity Pathway (IPA) para generar redes que muestran las regulaciones directas e indirectas /interacciones entre proteínas identificado en este estudio. Estas redes demuestran la participación de los jugadores clave, incluyendo el TNF alfa, NFkB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenina, y ERK1 /2 proteínas que regulan la inflamación, y la supervivencia y proliferación de las células tumorales (Figura 5). La mayoría de las dianas moleculares identificados en este estudio están regulados por c-myc, Her2 /neu, y TNF α, lo que sugiere la intervención de estas vías puede proporcionar un medio para el desarrollo de terapias moleculares dirigidas para el cáncer de endometrio.
Los potenciales nuevas dianas moleculares identificados en este estudio fueron sometidos a vía de análisis utilizando el software Ingenuity Pathways Analysis (IPA), versión 7.5. La figura muestra (líneas gruesas) y directos (líneas punteadas) indirectos regulaciones (→) /interacciones (-) entre los biomarcadores identificados en este estudio y otras proteínas asociadas significativamente. Estas redes revelan la participación de las proteínas clave que incluyen TNFa, NFkB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenina, JNK y ERK1 /2 proteínas que regulan la inflamación, la supervivencia y la proliferación.
Discusión
ha habido un interés reciente considerable en la identificación de posibles marcadores de cáncer para el diagnóstico y el pronóstico a través de análisis proteómico diferencial. Los diversos problemas, dificultades y éxitos de estos estudios de biomarcadores basados en proteómica se han discutido y revisado [14] - [17]. Nuestro estudio dio lugar a la identificación de 40 proteínas que muestran expresión diferencial significativa en EMCA en comparación con los tejidos proliferativos normales. Estas proteínas incluyen enzimas metabólicas [piruvato quinasa M2 (PKM2) y lactato deshidrogenasa A (LDHA)]; proteínas de unión a calcio (S100A6, calcyphosine y Calumenin); y proteínas implicadas en la regulación de la inflamación, la proliferación y la invasión [anexina A1 (ANXA1), interleucina potenciador de unión factor de 3 (ILF3), alfa-1-antitripsina (AAT), proteína de macrófagos tapado (CAPG) y la catepsina B]. Varios informes han demostrado la influencia de receptor de estrógeno (ER) y p53 en la expresión de estas proteínas, que garantiza la verificación de estas observaciones en los tejidos EMCA en una escala más grande. Entre las proteínas identificadas en este estudio, hemos informado anteriormente de expresión alterada de la AAT, CAPG, piruvato quinasa M1 /M2, y creatinasa quinasa B. Dos de estas proteínas (piruvato quinasa M2 y creatinasa quinasa B) se han incluido aquí para su consideración, investigación manual adicional de los datos reveló que mientras que los cambios de relación de la expresión de estas dos proteínas eran poco menos de 50% (piruvato quinasa M1 /M2, 1,43; y creatinasa quinasa B, 0,69), que cumplía con los otros dos criterios (ver Materiales y Métodos). Además, un estudio independiente mediante inmunohistoquímica en una micromatriz de tejido (n = 148 pacientes) realizado por nuestro grupo demostró la notable potencial de AAT y PKM2 como biomarcadores de diagnóstico para EMCA [18] - [20]. Es de destacar que el aumento de cantidad de PKM2 tumor también se ha reportado en las células tumorales y EDTA plasma de pacientes con cáncer de riñón pulmón tracto,, mama, cervical y gastrointestinal, así como en muestras de heces de pacientes con cáncer colorrectal y cáncer de estómago [21]. Por lo tanto PKM2 puede actuar como un indicador general de malignidad, en lugar de ser específico para EMCA. Esta asociación con la tumorigénesis en general es, tal vez, comprensible a la luz de la función de PKM2 [21]. El cambio a la isoforma M2 de piruvato quinasa en las células tumorales es necesaria para inducir el efecto Warburg. El aumento de expresión de PKM2 contribuye a un ambiente metabólico que es susceptible a la proliferación celular en condiciones de hipoxia y promueve el crecimiento de células tumorales [22], [23]. Por lo tanto, PKM2 actúa como un sensor metabólico, lo que permite a la célula tumoral para adaptar su metabolismo a las variaciones en el suministro de nutrientes. Curiosamente, LDHA también mostró sobreexpresión en tejidos EMCA en este estudio, y se sabe que PKM2 lanzaderas preferentemente piruvato a lactato deshidrogenasa [24]. Fosforilación de la tirosina de lactato deshidrogenasa facilita la proteína de unión a PKM2, canalizando así el producto de la piruvato quinasa a lactato [25]. Esto ayuda en la generación de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD
+) requerido para mantener una alta flujo glucolítico en las células tumorales. Esta conversión metabólica hace que la glucólisis autosuficiente, siempre y cuando la captación de glucosa elevada es factible. Una alta tasa glucolítica proporciona intermedios sintéticos para la rápida proliferación de las células tumorales, se requiere para replicar la biomasa de células y el genoma en cada división celular [24], [26].
Otro importante grupo de proteínas que se encuentran para ser desregulado en los tejidos EMCA incluye cuatro proteínas de unión a calcio: S100A6, calcyphosine (CAPS), Calumenin (CALU), y A1 anexina (Tabla 2). S100A6 es predominantemente una proteína citoplasmática, pero en presencia de Ca
2 +, que puede asociarse con la membrana plasmática y la envoltura nuclear. Nuestro análisis inmunohistoquímico mostró tinción citoplasmática y /o nuclear de S100A6, predominantemente en las células tumorales de endometrioide EMCA. Esto se ve apoyado por la presencia de la proteína S100A6 en el citoplasma y núcleos de pulmón, piel y células de adenocarcinoma pancreático ductal [27] - [29]. S100A6 juega un papel importante en la reorganización del citoesqueleto, la invasión, la supervivencia y la proliferación mediante la regulación de funciones de varias dianas moleculares, incluyendo p53, β-catenina, anexinas, tropomiosina, calponin, proteína /Siah-1-proteína de interacción de unión calcyclin-(CacyBP /SIP ), y Hsp90 /Hsp70-organización de la proteína (Hop) [30] - [33]. La sobreexpresión de S100A6 se ha asociado con un mal pronóstico en el pulmón, gástrico y cáncer de páncreas [27], [31], [33]. De los cuatro Ca
2 + proteínas reguladoras que se encuentran diferencialmente expresadas en este estudio, sólo se ha calcyphosine previamente ha informado que se asocia con un mal pronóstico en pacientes EMCA [34]. Anexina A1 (ANXA1), que se encuentra que se sobreexpresa en los tejidos EMCA en este estudio, es una proteína anti-inflamatoria endógena. Las anexinas son una familia de Ca
2 proteínas + /lípidos de unión que participan en diversas funciones celulares, tales como la agregación de membrana, la inflamación, la fagocitosis, la proliferación y la apoptosis [35]. En conjunto, estos resultados sugieren que el calcio-fosfatidilinositol y cascadas de AMP cíclico pueden desempeñar un papel importante en la regulación de la función celular, la proliferación, la diferenciación y en la carcinogénesis endometrial.
En particular, nuestro estudio también indica un papel importante de inflamación de regulación y ARN proteínas de unión en la EMCA de alto grado. La regulación positiva de la anexina A1 mencionada anteriormente junto con la regulación negativa de apolipoproteínas, fibrinógeno y haptoglobina sugiere la supresión del proceso inflamatorio en los tejidos que rodean el tumor. La interleucina-promotor de unión al factor de 3 (o ILF3 NF90) y A1 ribonucleoproteína heterogénea (hnRNP A1) son proteínas de unión de ARN que regulan la expresión de varias proteínas implicadas en la supervivencia y la proliferación de las células tumorales [36] - [38]. Entre otros, la sobreexpresión de H1 serpina, F-actina tapado subunidad de la proteína beta (CAPZB), macrófagos limitación de proteínas (CAPG), vilina 2 (EZR) y la catepsina B (CTSB) son conocidos para promover la motilidad celular y la invasión en los tejidos tumorales [ ,,,0],39] - [42]. Entre los marcadores moleculares potenciales que podrían ayudar en el diagnóstico o pronóstico de EMCA, algunos, como PKM2, LDHA y catepsina B ya se han explorado para su potencial terapéutico en otros tipos de cáncer. La inhibición de la PKM2 y LDHA, utilizando ARN corto de interferencia (siRNA) o inhibidores, demostraron una reducción de la proliferación celular debido a la inducción de estrés oxidativo que resulta en la apoptosis [43] - [47]. Por otra parte, la regulación por disminución de las células de cáncer de pulmón PKM2 sensibilizados a cisplatino y doxorrubicina mediada por siRNA. El potencial de estas proteínas para servir como dianas para terapias moleculares novedosas basadas diana, por lo tanto, necesita ser determinado en el contexto del cáncer de endometrio también.
En este estudio, el enfoque detallado mejoró el número de las proteínas identificadas, aunque se detectó un conjunto básico de péptidos en todas las carreras de cualquier muestra dada. Estos casos de detección repetida son atribuibles a los cambios en el tiempo de retención, colas de los picos, múltiples cargos, y las modificaciones (por ejemplo, de-amidación y la oxidación de la metionina). Tras el análisis de la primera serie iTRAQ, mejoramos la precisión de la inyección fracción y ampliado las ventanas de exclusión por tiempo y
m /z
, de ± 5 a ± 7 min, y de 100 a 120 ppm mDa , respectivamente, para mitigar algunos de estos retos. Elegimos no excluir iones basados en las diferencias de carga o modificación, ya que esto habría aumentado la lista de exclusión más allá de un tamaño práctico, y, además, que razonó que algo de redundancia basado en las diferencias de carga o modificación puede servir para aumentar la confianza de identificación. Por lo tanto el análisis iterativo se empleó un equilibrio entre la profundidad del análisis y de la docilidad. Sin embargo, esta identificación a través de múltiples péptidos significa que el número de proteínas identificadas probablemente aumentó a una tasa más lenta de lo que hubiera sido posible si se implementó la exclusión de diferentes estados de carga y modificaciones. Curiosamente, el número total de las proteínas identificadas en este estudio fueron similares a los identificados en nuestro estudio anterior (1529 frente a 1388 proteínas, respectivamente), a pesar de trabajar aquí con sólo la mitad de la cantidad de material de partida (100 frente a 200 g /muestra utilizada anteriormente ) [18].
en conclusión, nuestro análisis revela claramente la importancia de enfoque proteómico de drill-down en combinación con iTRAQ en la identificación de biomarcadores candidatos para el cáncer de endometrio. Este estudio revela con éxito novela proteínas expresadas diferencialmente que podrían servir como dianas moleculares en el diagnóstico y /o pronóstico de endometrioides tejidos EMCA. Algunas de estas proteínas exhiben potenciales como dianas moleculares para la terapéutica.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
tejidos endometriales fueron recuperados de una investigación dedicada endometrial del tejido de la casa banco como se describe anteriormente [18]. La recopilación y el uso de estos materiales fueron aprobados por las Juntas de Investigación de Ética de la Universidad de York, Mount Sinai Hospital, University Health Network, y el Hospital General de North York. Las muestras procedían de pacientes sometidos a histerectomía u otros procedimientos clínicos con biopsias. Todas estas muestras se obtuvieron después de consentimiento informado por escrito de todos los participantes involucrados en este estudio.
Las muestras y reactivos
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). Para este estudio, los casos de carcinoma endometrioide (Tipo I EMCA, n = 10) y el endometrio proliferativo normal (n = 10) fueron seleccionados. Cinco de las muestras de tejido de tipo I EMCA eran de biopsias que habían sido examinados en nuestro estudio anterior. Para el análisis de proteómica, muestras de tejido se obtuvieron del espejo de la cara del bloque residual utilizado para la evaluación histopatológica por el patólogo. Las muestras de tejido se lavaron tres veces en ~ 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una mezcla de inhibidores de proteasa (1 mM 4- (2-aminoetil) de fluoruro de bencenosulfonilo, 10 mM de leupeptina, 1 mg /ml de aprotinina, y 1 micra pepstatina) como se describe anteriormente [18]. La muestra lavada se homogeneizó en 0,5 ml de PBS con inhibidores de proteasa usando un homogeneizador de mano, flash-congelado en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso [18]. Después de la recuperación de almacenamiento a -80 ° C, las muestras se descongelaron, se clarificaron por centrifugación, y se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, CA). Para todos los conjuntos de iTRAQ, se utilizó una muestra de referencia que comprende un conjunto de las diez muestras de proliferación normal (100 g de lisado de cada tejido). Para cada experimento, 100 g de proteínas se digirieron con tripsina y etiquetados individualmente con la etiqueta iTRAQ apropiado. Las asignaciones de las etiquetas a los tipos de muestra fueron asignados al azar para minimizar cualquier sesgo potencial en el etiquetado de eficiencia entre las versiones individuales de las etiquetas iTRAQ. Un total de siete conjuntos iTRAQ se examinaron, comprendiendo cada uno tres de un total de 20 muestras individuales - EMCA diez y diez endometrios normales - y la reserva de referencia. Ratón anticuerpos monoclonales contra Calumenin y hnRNPA1 estaban disponibles de Abcam, catepsina B de Calbiochem, y S100A6 desde Santa Cruz Biotech. policlonal de conejo lactato deshidrogenasa A (LDHA) también se obtuvo de Santa Cruz Biotech.
fuerte de intercambio catiónico (SCX) Separación
Cada conjunto iTRAQ se separó mediante SCX usando un instrumento HP1050 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA) con un 2,1 mm de diámetro interno x 100 mm de longitud PolyLC polisulfoetil una columna rellena con perlas de 5-m con 300-Å poros (El Grupo Nest, Southborough, MA) como se describe anteriormente [18]. En pocas palabras, el conjunto iTRAQ se diluyó con el tampón de carga (idéntica en composición a tampón A: KH 15 mM
2 PO
4 en 25% de acetonitrilo, pH 3,0) hasta un volumen total de 1,8 ml, y el pH se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico. Después, la solución se filtró usando un filtro de jeringa de 0,45 mm (Millipore, Cambridge, ON, Canadá) antes de cargar en la columna. La separación se realizó usando un gradiente binario lineal durante 1 h, además de 30 min de la columna de re-equilibración (Tabla 4). Como se describió anteriormente, el tampón A era idéntica en composición a la del tampón de carga; Tampón B era tampón A que contiene cloruro potásico 350 mM; y el Tampón C era tampón A que contiene 1 M de cloruro de potasio. Las fracciones se recogieron cada 2 min usando un SF-2120 de Super colector de fracciones (Advantec MFS, Dublin, CA) después de una espera inicial de 2 min para acomodar el volumen de huecos. Esto dio lugar a un total de 30 fracciones de SCX por serie iTRAQ. Estas fracciones se secaron usando Speed-Vac (Thermo Savant SC110 A, Holbrook, NY) y re-disolvió en un volumen mínimo de 5% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%: típicamente 8 l para cada fracción No. 6-9, 12 l para No. 10-13, 16 l de N ° 14-16, 20 l para el Nº 17-19, 25 l durante Nº 20-21, y 30 l durante las últimas fracciones, N ° 22-30. Los volúmenes más grandes en las fracciones posteriores fueron necesarios por la necesidad de disolver completamente los gránulos de sal más grandes que resultan de su contenido en sales correspondientemente más altas. Las fracciones N ° 1-5, no se analizaron como fracciones tempranas en su mayoría contenían iTRAQ subproductos.
fase inversa (RP) LC-MS /MS
Las fracciones de SCX No. 6-30 de cada conjunto iTRAQ fueron analizadas por nano línea LC-MS /MS utilizando el instrumento LC Embalaje final (Amsterdam, Países Bajos) equipado con un bucle de muestra de 10 mL. El inyector automático se utiliza en el modo de recogida microlitro. Para cada muestra, 1 l solución se cargó en una fase inversa (RP) C18 precolumna de 5 mm (LC Packings) a 25 l /min y se lavó durante 4 minutos antes de cambiar la precolumna en línea con la columna de separación. La columna de separación utilizada fue una columna capilar de diámetro x 150 mm de longitud de 75 micras-interno (Integrafrit capilar de Nueva Objetivo, Woburn, MA) envasado en la empresa con perlas C18 de 3,5 micras con poros de Kromasil 100 Å (Akzo Nobel /EKA Chemicals Inc, Nueva York). La velocidad de flujo se utiliza para la separación en la columna de RP fue de 200 nL /min. El disolvente A era 5% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%; Disolvente B era 95% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%. El gradiente de disolvente se detalla en la Tabla 5. Una nueva columna se utilizó para cada conjunto iTRAQ.
Online MS /MS se llevó a cabo en un /tándem QSTAR Pulsar híbrido cuadrupolo tiempo de vuelo (QqTOF)