Extracto
La obesidad ha sido implicado como un factor de riesgo significativo para el desarrollo de cáncer de páncreas. En el contexto de la obesidad, una respuesta inflamatoria crónica sistémica se caracteriza por alteraciones en la producción y secreción de una amplia variedad de factores de crecimiento. La leptina es una hormona cuyo nivel aumenta drásticamente en el suero de los pacientes obesos. obesidad inducida por dieta alta en grasa en ratones conduce a un aumento del peso total del cuerpo, peso pancreático, leptina en suero, y los niveles de leptina tejido pancreático. Aquí se presenta la contribución de la obesidad y la leptina para el crecimiento del cáncer pancreático utilizando un
in vivo
ortotópico murino modelo de cáncer de páncreas, lo que resultó en un aumento de la proliferación tumoral con un aumento de la carga tumoral concomitante en la dieta ratones obesos inducidos compararon a inclinarse ratones . Se encontraron líneas celulares de cáncer pancreático humano y murino para expresar el corto, así como la forma larga del receptor de leptina y funcionalmente respondieron a la leptina inducida por la activación a través de un aumento de la fosforilación de AKT473. In vitro, la estimulación de leptina aumentó la migración celular que fue bloqueado por la adición de un inhibidor de PI3K. In vivo, el agotamiento del receptor de leptina a través de shRNA desmontables parcialmente abrogada aumentó el crecimiento del tumor ortotópico en ratones obesos. Estos hallazgos sugieren que la leptina contribuye al crecimiento del tumor de páncreas mediante la activación de la /vía PI3K AKT, que promueve la migración de células tumorales de páncreas
Visto:. Mendonsa AM, Chalfant MC, Gorden LD, VanSaun MN (2015) Modulación de el crecimiento del tumor leptina receptor media y la migración de las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 10 (4): e0126686. doi: 10.1371 /journal.pone.0126686
Editor Académico: José G. Treviño, Universidad de Florida, Estados Unidos |
Recibido: 17 de octubre de 2014; Aceptado: April 7, 2015; Publicado: 28 de abril el año 2015
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Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación: La investigación fue apoyada por el páncreas 2010 Premio cáncer de Acción Red-AACR Desarrollo de carrera, la subvención Número 10/20/25-furgonetas y NIH#5U01CA143072 proporcionan apoyo salarial para el AMM, MCC, MNV, y LG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la obesidad y la diabetes se ha demostrado que son factores de riesgo independientes para el desarrollo de un número de cánceres epiteliales incluyendo adenocarcinoma de páncreas. A nivel mundial, las tasas de obesidad han aumentado a un ritmo sin precedentes en la última década [1]. La obesidad complica por el síndrome metabólico y la diabetes mellitus tipo 2 son comúnmente condiciones comórbidas [2]. Se ha sugerido que la diabetes pueden estar vinculados con el desarrollo y progresión del cáncer pancreático como 80% de los pacientes con cáncer de páncreas experimentan alguna forma de diabetes o alterado sensibilidad a la insulina [3]. índice de masa corporal (IMC) y un aumento de 10 cm de circunferencia de la cintura presentó una aumento del riesgo relativo de 1,11 para la incidencia de cáncer de páncreas [4]. Además, los modelos murinos han demostrado la importancia de la dieta en el desarrollo de los cánceres de páncreas [5, 6].
obesidad crónica lleva a la alteración en la producción y secreción de las adipoquinas, las citoquinas secretadas por el tejido adiposo [ ,,,0],7-12]. La leptina es una de esas adipocina que se incrementa dramáticamente en los pacientes obesos [8, 9]. La leptina, normalmente conocido por su capacidad para regular el gasto de energía y la saciedad [13], se une a múltiples isoformas de la leptina (ob; obeso) receptor. La forma corta del receptor es conocido para señal a través de la vía PI3K /AKT mientras que la forma larga del receptor de leptina se sabe que la señal a través de la vía JAK-STAT y de inducir la fosforilación de STAT3 [14-16]. El aumento de la leptina se ha informado en subconjuntos de pacientes con cáncer y demostrado para estimular la proliferación de células de cáncer de colon, la migración de células de cáncer de mama, la migración y la invasión glioma, así como el crecimiento de células colangiocarcinoma
in vitro
. [17-21]
El papel de la leptina y su receptor de señalización en el desarrollo del cáncer de páncreas y la progresión sigue estando mal definido. Los primeros estudios demostraron que
in vitro
tratamiento de las células del cáncer pancreático con bajos niveles de leptina indujo una disminución de la actividad metabólica [22].
in vitro
estudios en el crecimiento y la metástasis de una línea celular de cáncer de páncreas murino demostrado ha demostrado ser aumentado en los ratones genéticamente obesos causada por la pérdida de la leptina o la pérdida de la isoforma larga del receptor de leptina [23]. adipocitos tumorales También se demostró que existe una correlación positiva con la proliferación de xenoinjertos de cáncer de páncreas implantados en ratones obesos [24]. Además, la enfermedad no alcohólica grasos de páncreas (NAFPD) y steatopancreatitis se encontraron representan un factor de riesgo potencialmente significativo para el cáncer pancreático humano [25].
Para entender si la expresión tumoral de los receptores de leptina regula el crecimiento de los cánceres de páncreas en el ajuste de la obesidad, que forma ortotópica inyectado células de cáncer de páncreas en ratones obesos y delgados que utilizan la tecnología de interferencia de ARN para agotar el receptor de leptina de las células de cáncer de páncreas. Los resultados demuestran que la expresión del receptor de leptina potencia de páncreas independiente el crecimiento del tumor de la proliferación de células tumorales.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se realizó de acuerdo con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud y la aprobación de la Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión /Oficina de Aseguramiento de Bienestar Animal (M /12/277). la vivienda y el cuidado de los animales estaba en conformidad con una instalación para animales de laboratorio acreditado. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los métodos aprobados para reducir el número de animales y cualquier molestia animales potencial.
Ratones y dieta Manipulación
ocho semanas de edad C57BL /6J macho se obtuvieron de Research Jackson laboratorios, separados en jaulas apropiadas y se alimentaron con una dieta magra del 13,5% de grasa (5001, LabDiet: 13,5% de calorías de grasa, 58% de hidratos de carbono, y el 28,5% de proteína) o alimentados con una obesidad inducir la dieta de 42% de grasa "DIO , inducida por la dieta obesidad "(TD.88137, Harlan Teklad: 42% de calorías de la grasa, el 42,7% de hidratos de carbono, y un 15,2% de proteínas) a voluntad. El peso corporal y el peso pancreático total se midió después de tres meses en la dieta. Se recogió plasma de los ratones y los niveles de leptina fueron evaluados a través de un ensayo con ratones Quantikine específica de acuerdo con el protocolo del fabricante (I + amp; D Systems).
se cosecharon el crecimiento del tumor ortotópico
cáncer de páncreas células a través de tripsina /EDTA cuando 80% de confluencia. Las células se resuspendieron en solución salina de calidad farmacéutica y se inyectaron ortotópicamente en la cola del páncreas de ratones obesos magra y la dieta inducida para establecer los tumores. En resumen, los ratones fueron anestesiados con isoflurano mediante inhalación y una incisión paramediana se hizo en el abdomen. La cola del páncreas se exterioriza y 2.5x10
5 células de cáncer pancreático se resuspendieron en 25 ul de solución salina veterinaria y se inyecta en la cola del páncreas con una aguja de calibre 27. Una burbuja de inmediato asegurada una inyección precisa y un bastoncillo de algodón aplicado durante la retirada de la aguja asegura que las células no se vertieron en el abdomen. El páncreas fue cuidadosamente colocado de nuevo en su posición anatómica y los ratones se sutura y se permitió recuperar bajo la supervisión aprobado por el IACUC. Los tumores se dejaron crecer hasta un punto final de 28 días y los ratones se sacrificaron mediante una sobredosis de dióxido de carbono. Los tumores se extirparon junto con el páncreas restantes, pesados, fijados en paraformaldehído al 4% durante la noche, y luego se procesaron para el análisis histológico. Hematoxilina /eosina o tricrómico secciones teñidas fueron escaneadas de 20 aumentos con un Ariol SL-50 del escáner (Leica). área del tumor, el número de adipocitos y adipocitos se calculó el tamaño del tumor en el punto medio usando imágenes Ariol en asociación con el software de análisis de imágenes digitales Hub (Leica). Para el análisis bioluminiscente de imágenes, imágenes in vivo se realizó el día después de la inyección y cada semana posterior a través de un sistema de IVIS 200 (Xenogen). La bioluminiscencia se midió para cada ratón en cada día utilizando los mismos parámetros de exposición. La cuantificación de flujo total se calculó con la vida de software de análisis de imágenes mediante la creación de una zona predefinida de interés que se mantiene constante para todos los ratones. se utilizó y apropiado secundario /terciario para determinar el número de la proliferación de células cancerosas: El análisis inmunohistoquímico para Ki67 (250, Abcam Ab15580 1). tinción de Ki67 se cuantificó mediante la evaluación del número total o el área por ciento de núcleos teñidos positivamente dentro del tumor. El análisis post-adquisición y el análisis estadístico se realizó utilizando el software de análisis GraphPad Prism.
Líneas Celulares
Estándar de células previamente publicado métodos de cultivo se utilizan para mantener líneas celulares de cáncer de páncreas, incluyendo murino Panc02 (NIH repositorio , el DTP /DCTC /NCI [26]), PanIN 4313 [27], K8484 y DT8082 [28], así como humana MiaPaca-2, Panc1, y BxPC-3 (ATCC; CRL-1420, CRL-1469, CRL- 1687). Luciferase etiquetada líneas celulares se generaron mediante la infección de las líneas celulares con un título lentiviral comercial para luciérnaga-luciferasa (Genecopoeia, LPP-FLUC-LV105-025 que contiene 1x10
8 TU /ml). Las células no infectadas se eliminan después de la adición de puromicina (10 ug /ml, Sigma). La expresión de luciferasa fue confirmada por cada línea a través de un análisis de Glo (Pierce).
Análisis de PCR en tiempo real
Se extrajo ARN de cada línea celular utilizando una extracción Qiazol combinado y Qiagen RNeasy mini kit de purificación. Un microgramo de ARN total fue transcrito invertir utilizando los ADNc de alta capacidad kit de transcripción (Applied Biosystems) se invierten. PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos para el receptor de leptina murina; QT00154133, QT01045380, y QT01045373 (Qiagen) en combinación con el kit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un tiempo real sistema de detección de PCR CFX96 (Bio-Rad). Cada transcripción en cada muestra se sometió a ensayo tres veces y las relaciones de veces de cambio entre las muestras experimentales y de control para cada gen utilizados en el análisis se calcularon utilizando 18S niveles como una referencia. los receptores de leptina humana cebadores cuantitativos fueron los siguientes para una región común del receptor de leptina (adelante: 5'TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT, revertir: 5'CACACCAAAGAATGAAAAAGCTAT), la forma corta del receptor de leptina (adelante: 5'TTCCTGGGCACAAGGACTTA, revertir: 5'GCTCCAAAAGAAGAGGACCA) y la forma larga del receptor de leptina (adelante: 5'TTCCTGGGCACAAGGACTTA, revés: 5'TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA). cebadores de los receptores de la leptina humanos para la RT-PCR usaron un cebador directo e inverso común 5'CGTGCAGTCACTCAGTGCTTA cebadores para detectar el corto 5'TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA forma o la forma larga 5'GCTCCAAAAGAAGAGGACCA. cebadores de control para la actina beta humana fueron adelante 5'GAGCACAGAGCCTCGCCTTT y 5'ATCCTTCTGACCCATGCCCA inversa.
Edu ensayo de proliferación
La proliferación se evaluó mediante el uso de un análisis basado en la citometría de flujo EdU. Brevemente, 1x10
5 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se dejaron unir durante la noche. Las células fueron entonces privadas de suero durante 8 horas, seguido de tratamientos adecuados para 24 horas más. EdU se añadió al medio de cultivo a 25μM durante las últimas 3 horas de tratamiento para su incorporación. Al final del tratamiento, las células se liberan con tripsina /EDTA y después se lavó con PEB (PBS /EDTA 2 mM /1% BSA). Las células se fijaron con 2% de formalina tamponada durante 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron a 300xg, aspiraron y después se aclararon en PBS que contenía 1% de BSA. Las células se permeabilizaron con adición de 0,25% de Triton durante 15 minutos, se sedimentaron a 450xg y después se lavaron con PBS /BSA y se sedimentaron de nuevo. Las células se marcaron en una mezcla de reacción que contiene 150 mM de Tris pH 8,5, 1,5 mM CuSO4, 10 mM 647-azida, y ácido ascórbico 100 mM (añadido en orden) durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se detuvo por adición 5 veces mayor de tampón PEB. Las células se marcaron con 1 ug /ml de yoduro de propidio y se sedimentaron a 450xg. Las células se resuspendieron en 250μl de PEB y luego cuantificaron por citometría de flujo en un citómetro de Accuri C6. Las células fueron cerrada por SSC frente a FSC y se midió el porcentaje de células positivas PI dentro de la puerta de valor positivo EDU-647.
Migración de ensayo
La migración celular se evaluó mediante un ensayo de cero. células de cáncer de páncreas (2,5 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en medio completo y se dejaron adherir durante la noche y llegar a la confluencia. Tras la confluencia células fueron privaron de suero durante 8 horas. Las células fueron entonces se rascaban con una punta de pipeta para producir una herida libre de células y medios de comunicación se cambió a las condiciones de tratamiento apropiadas. La leptina se administró a 250 ng /ml con y sin la adición de LY294002 (20μM, Sigma) y se cultivaron durante 24 h adicionales a 37 ° C en 5% de CO
2. La anchura cero se registró inmediatamente después del cero y de nuevo a las 24 horas después del cero. La anchura cero se calculó en tres posiciones en cada pocillo y se expresa como una media y después se midió en cuatro experimentos.
Análisis Western
Los lisados de líneas celulares de cáncer de páncreas se recogieron en el hielo frío tampón RIPA (50 mM de Tris pH 7,4, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 10 mM de NaF, 1 mM de Na
3Vo
4, 0,5% desoxicolato de sodio, y 1% de Triton X-100) con un amplio espectro completa Mini cóctel inhibidor de la proteasa (Roche), así como cóctel inhibidor de fosfatasa (Cell Signaling, 5870S). Los lisados se sometieron a ultrasonidos brevemente, se centrifugaron a 10.000xg durante 15 min y la concentración de proteína total en el sobrenadante se midió mediante el análisis de proteínas BCA (Pierce). Control de lisado COLO 320DM se obtuvo de Santa Cruz (sc-2226). 25μgs de los lisados se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, se bloquearon con 3% de BSA y entonces se transfirieron con anticuerpo primario: LEPR (SantaCruz (K-20), sc-1835 1: 250 y (H-300) sc-8325 1: 250), pAKT473 (Cell Signaling, 4060S 1: 1000), Takt (Cell Signaling, 4821S 1: 1000), pSTAT3 (Cell Signaling, 9145L 1: 1000), tSTAT3 (Abcam, ab5073 1: 1000), pAMPK ( Abcam, Ab133448 1: 1000), tAMPK (Cell Signaling, 2603S 1: 1000), y la actina (Abgent, AM1829b 1: 3000). anticuerpos secundarios apropiados conjugados con IR680 y IR800 (Rockland 1: 10.000) se utilizaron conjuntamente con la adquisición Odyssey Imagen y análisis densitométrico (Li-Cor Biosciences). Densitometría para pAKT se comparó con los niveles de Takt y pSTAT3 se comparó con los niveles de tSTAT3, que luego se compararon respectivamente al punto de tiempo cero o el control de los padres. Densitometría para los receptores desmontables líneas de control y de leptina se compararon con la actina y luego normalizaron a los niveles de los padres.
shRNAmir Derribo
Los títulos lentivirales se produjeron a partir GIPZ construcciones de vectores de múltiples regiones del receptor de leptina murina ( V2LMM 70436 y 190793 V2LMM, ThermoScientific) o para un vector de control (RHS4480) usando el sistema de paquetes de Trans-Lentiviral de acuerdo con el protocolo del fabricante (Open Biosystems). sobrenadantes lentivirales de título se concentraron usando solución y 2.5x10 concentración Lenti-Pac
5 células de cáncer de páncreas fueron transducidas según el protocolo recomendado por el fabricante (Genecopoeia). Después de la transducción, se aislaron células positivas en virtud de 10μg /ml puromycin selección y confirmaron visualmente para detectar la expresión de GFP. Además, la precipitación fue confirmada para el ARNm mediante qPCR y para la proteína a través de Western blot.
Resultados
Dieta inducida por la obesidad contribuye a la adiposidad de páncreas
Ha previamente ha informado de que el consumo de una dieta alta en grasa conduce a la obesidad, resistencia a la insulina y el aumento de los niveles de leptina por dieciocho semanas de edad en ratones [29]. Además, se ha demostrado que la propia páncreas humano está sujeto a la infiltración grasa, identificado como enfermedad pancreática graso [25]. Para determinar si la dieta inducida por la obesidad podría dar lugar a la infiltración grasa del páncreas murino, los ratones se mantuvieron en una dieta alta en grasas durante tres meses. Los animales mostraron un dramático aumento en el peso corporal total, así como el peso de páncreas en la dieta obesos (DIO) ratones inducida (Fig 1A y 1B). peso de páncreas fijo y seco medio en ratones delgados se 0.221g en comparación con 0,325 g para los ratones obesos. El examen histológico de páncreas de ratones obesos inducidos por dieta magra y mostró la presencia de ambos adiposo interpancreatic y intrapancreática en los ratones DIO (Fig 1C y 1D). El número de adipocitos por mm
2 de tejido acinar, así como el tamaño de los adipocitos peripancreáticos fue significativamente mayor en el páncreas DIO (Fig 1E y 1F). Además, se determinó que los ratones tenían un aumento de 20 veces (promedio para magra fue 3.155ng /ml y DIO se 60.156ng /ml) en los niveles de leptina en plasma después de doce semanas en la dieta (Figura 1G). los niveles de leptina normales se encuentran típicamente en 1-10ng /ml en el suero humano y 10-50ng /ml en los pacientes obesos [30]. En el contexto de un aumento adiposo de páncreas, se encontró que los niveles de tejido relativos de la leptina en el páncreas que aumentarse en DIO páncreas en comparación a inclinarse páncreas (Figura 1H).
Los ratones se mantuvieron con una dieta alta en grasa 42% durante 3 meses para inducir la obesidad. DIO ratones ganaron peso significativamente más corporal total (A), así como el peso de páncreas (B). El análisis histológico de páncreas total a partir de magra (C) en comparación con los ratones DIO (D) mostró acumulación de interpancreatic (flecha blanca) y intrapancreáticos (puntas de flecha negras) adiposo en DIO páncreas. El número total de adipocitos intrapancreáticos (E), así como el tamaño de los adipocitos peripancreáticos (F) fue mayor en el páncreas DIO. Los niveles de leptina se incrementaron en ambas muestras de plasma y tejido pancreático de ratones obesos (G). Las barras de escala son 100μm.
aumenta la obesidad inducida por la dieta ortotópico el crecimiento del tumor de páncreas
La obesidad es un factor de riesgo significativo para muchos tipos de cáncer y se ha demostrado potenciar su crecimiento en ratones [5, 31, 32]. Para examinar si la obesidad inducida por la dieta era suficiente para aumentar el crecimiento del cáncer pancreático
in vivo
, se utilizó un modelo de cáncer de páncreas murino singénico ortotópico. Hemos demostrado anteriormente que la obesidad inducida por la dieta incrementó el número de metástasis hepáticas en un modelo de inyección esplénica de la metástasis del cáncer de colon en el contexto de la enfermedad de hígado graso [33]. Utilizando un modelo EL-Kras se ha demostrado que la obesidad propensas ratones C57BL /6J alimentados con grasa omega-6 tienen un inicio más temprano y una mayor frecuencia de PanIN, neoplasia intraepitelial pancreáticas, las lesiones [5]. Por lo tanto, postulamos que la dieta inducida por la obesidad y el desarrollo de NAFPD en ratones también pueden aumentar el crecimiento de los cánceres pancreáticos. ratones C57BL /6J fueron colocados en una dieta alta en grasas durante tres meses para inducir la obesidad. células de adenocarcinoma de páncreas Panc02 fueron inyectadas de forma ortotópica en la cola del páncreas y monitoreados para el crecimiento. En el crecimiento del tumor primario in vivo se controló usando la bioluminiscencia (IVIS) de análisis de imágenes en combinación con luciferasa marcado células Panc02 (Fig 2A). tumores Panc02 ortotópicamente implantados en la dieta inducida ratones obesos mostraron un aumento significativo en flujo total de fotones después de nueve días de crecimiento y un crecimiento continuo en el tiempo mientras que los tumores en los ratones mostraron un crecimiento lento magra durante el mismo período de tiempo (Fig 2B). análisis ex vivo a los 28 días después de la inyección confirmó el crecimiento del tumor más grande en la dieta ratones obesos inducidos en comparación con los ratones delgados calculado como el peso total del tumor (Fig 2C). escaneo Ariol con análisis computacional también mostró un aumento del área del tumor en los ratones obesos (Fig 2D). tumores de punto final se tiñeron para el marcador de proliferación Ki67 y observó una elevación significativa la proliferación de células tumorales en ratones DIO en comparación con los ratones inclinarse (Figura 2E).
La bioluminiscencia indicó incremento de crecimiento en el tiempo en ratones DIO en comparación con los ratones inclinarse (A) . flujo total de formación de imágenes de la luciferasa fue estadísticamente diferente por Día 09 después de la inyección de células tumorales ortotópico (B). punto final de peso del tumor (C), así como el área del tumor (D) se incrementaron significativamente en los ratones DIO. Proliferación evaluado por tinción de Ki67 se incrementó en los tumores en comparación DIO a inclinarse tumores (E). Resplandor escala del mapa de calor es x10
5 p /seg /cm
2 /sr. El análisis estadístico de Mann-Whitney de p. & lt; 0,0079 (*) guía empresas
líneas celulares de cáncer de páncreas expresan receptores de leptina funcionales
Los estudios han demostrado que las células beta pancreáticas expresan receptores de leptina funcional [ ,,,0],34], sin embargo, los niveles de expresión del receptor y la función en el cáncer de páncreas no ha sido abordado. Para determinar si las células de cáncer de páncreas expresan receptores de leptina, se aisló el ARN y las proteínas de múltiples líneas celulares de cáncer pancreático humano y murino. Se realizó análisis de transferencia de Western para determinar el nivel relativo de proteínas de la leptina receptores en nuestro panel de líneas celulares de cáncer de páncreas. Tanto la isoforma corta (LR-corta) y la forma larga (LR-Long) estaban presentes en las líneas celulares de cáncer pancreático, sin embargo, la forma larga en líneas humanos se detectó sólo débilmente utilizando el anticuerpo K-20 (Fig 3A) Presencia de la isoforma larga del receptor de leptina se verificó, además, utilizando el anticuerpo H-300 (figura S1B). Ambas formas se detectaron, además, a través de análisis de PCR en murino, así como líneas celulares humanas (Fig 3B y 3C y S1A Fig). Las líneas celulares fueron tratados con leptina exógena a 5 ng /ml, 50 ng /ml, y 250 ng /mL para determinar el grado de activación pAKT y pSTAT3. El análisis de Western junto con densitometría, mostró que la leptina inducida por la activación de pAKT-S473 en líneas Panc02 y Panc1, pero no en la línea de células MiaPaca (Fig 3D). la activación inducida por leptina de pAKT fue suprimida aún más por el inhibidor de PI3K LY294002 a los 30 y 60 minutos (Fig 3E). La leptina estimula pSTAT3 en la línea celular humana Panc1 con el aumento de la concentración, aunque las concentraciones más bajas fueron más eficaces en la inducción de pSTAT3 en la línea de Panc02 murino y en las líneas de células MiaPaca2 (figura 3D). Estos resultados demuestran que las células de cáncer de páncreas expresan receptor de leptina funcional, sin embargo, la estimulación del ligando de cualquiera de pAKT o pSTAT3 depende del tipo de línea celular de cáncer de páncreas.
análisis Western y en tiempo real qPCR verificó la expresión del receptor de la leptina para la formas larga y corta del receptor de la leptina en murinos y las líneas de células pancreáticas humanas (a, B, C). anlayis Western mostró estimulación de líneas celulares de cáncer pancreático con la leptina conduce a la fosforilación de AKT en las líneas celulares Panc02 y Panc1, y a la fosforilación de STAT3 (D). Además del inhibidor de PI3K /AKT LY294002 fue capaz de bloquear la fosforilación inducida por la leptina de pAKT pero no afectó a la leptina inducida por la activación pSTAT3 en la línea celular Panc1. Se utilizó el análisis densitométrico de cuantificar la cantidad de pSTAT3 y pAKT relación con los niveles totales para cada proteína y luego normalizada a cero punto de tiempo.
La leptina estimula la proliferación de células de cáncer de páncreas murino
leptina se ha demostrado para estimular la proliferación en una variedad de líneas celulares de cáncer [21, 35-38]. El aumento del nivel de leptina en el plasma, así como el tejido pancreático sugirieron que la leptina podría estar involucrado en el crecimiento del tumor de páncreas. La activación de pAKT o pSTAT3 se ha asociado con la proliferación inducida por la leptina, la supervivencia, la tolerancia inmune y la invasión en las células del cáncer [35, 36, 39-42]. Contrariamente a múltiples estudios que muestran la activación de la proliferación en células de cáncer tras la estimulación de la leptina, se informó el tratamiento de células MiaPaca o Panc1 con leptina para causar una disminución en su actividad metabólica a través de un ensayo de MTT [22]. Debido a la mayor pAKT y pSTAT3 observados en nuestros estudios con tratamientos de leptina, estábamos interesados en determinar cómo la leptina altera la estimulación de la proliferación de líneas celulares de cáncer de páncreas. ensayos de incorporación de Edu se realizaron con el fin de determinar si la leptina efectúa la proliferación de células de cáncer de páncreas (Fig 4A). La leptina estimulación mostró un aumento significativo en la proliferación a través de Edu incorporación de la línea celular murina Panc02 y la línea celular humana Panc1 a todas las concentraciones ensayadas, sin embargo, no alteró la proliferación en la línea celular MiaPaca en cualquier concentración ensayada.
estimulación leptina a los 5, 50, y 250 ng /ml provocó un aumento en la proliferación evaluado a través de EdU incorporación en líneas celulares de Panc02 y Panc1 humano murinos pero no alteró la proliferación en las células MiaPaca humanos (a). estimulación leptina provocó un aumento de la migración registra como distancia migrada por células Panc02 y Panc1 evaluados a través del ensayo cero que fue bloqueada por el inhibidor de PI3K LY294002 (B). El análisis estadístico por ANOVA de * p & lt; 0,0001, y ** T-test de p. & lt; 0,05
La leptina aumenta la migración de las células de cáncer de páncreas
Además de la proliferación, la leptina tiene también ha demostrado que aumenta la capacidad migratoria de las células del cáncer [18, 19, 43, 44]. El análisis histológico de los tumores en ratones obesos mostró un alto grado de infiltración de células tumorales en el tejido adiposo peri-pancreática en los ratones DIO en comparación con los ratones magra (datos no mostrados). Esto sugirió que las células de cáncer pancreático podrían estar respondiendo con una mejora de la motilidad y la migración a citoquinas o adipoquinas liberados por el tejido adiposo. Para determinar si la leptina, además, podría actuar como un factor migratoria de células de cáncer pancreático se realizaron ensayos de cero. los ensayos de cero demostraron que la leptina aumentó significativamente la migración de los Panc02 así como las células Panc1 in vitro (Fig 4B), mientras que las células MiaPaca no mostraron activación migratoria en respuesta a la leptina. La adición del inhibidor de PI3K /AKT LY294002 bloqueado migración leptina inducida de células de cáncer de páncreas.
Desmontables de receptor de leptina
Con el fin de determinar la contribución del receptor de leptina para el crecimiento del cáncer de páncreas en ratones obesos , derribaron la expresión del receptor de leptina utilizando técnicas basadas lentiviral shRNAmir en la línea celular murina Panc02. Hemos sido capaces de obtener una reducción significativa en la expresión de ARN tanto de los de largo, así como las formas cortas de receptor de leptina utilizando dos diferentes construcciones de shRNAmir, LRKD1 y LRKD2 (Fig 5A). El análisis de proteínas a través de Western blot y análisis densitométrico confirmó el efecto caída con ambos constructos (figura 5B). Además, desmontables del receptor de leptina también confirió una disminución en los niveles de activación de pAKT y pSTAT3 (Fig 5B). El uso de un ensayo de proliferación basada Edu hemos sido capaces de demostrar que las líneas de derribo tenían una tasa de proliferación basal más baja en medio libre de suero (Figura 5C). La estimulación de las dos células de los padres y de control shRNA Panc02 con leptina inducida por un aumento en la proliferación de que no se dio en las células LRKD1 o LRKD2 Panc02 (Figura 5D).
Long y los niveles de ARN del receptor de leptina cortos medidos en tiempo real a través de análisis de PCR ambos fueron significativamente disminuido el uso de dos títulos diferentes lentiviral shRNAmir en la línea celular Panc02 (a). El análisis densitométrico occidental y confirmó receptor de leptina desmontables, así como la reducción de la activación de pAKT (B). proliferación basal se redujo significativamente tanto en las líneas de células desmontables LRKD1 y LRKD2 cuando se cultiva en condiciones libres de suero (C). La estimulación con leptina a 50 ng proliferación /mL inducida en células de los padres y de control, pero no para inducir la proliferación (cambio porcentual en comparación con el no tratado) en cualquiera de las líneas celulares desmontables en comparación con los de los padres o el control shRNA (D). El análisis estadístico por ANOVA * representa p & lt; 0,014 corto, p & lt; 0,0023 largo, p & lt; 0,0003 común (A); ANOVA p & lt; 0,0008 (C) .; ANOVA p & lt; 0,0001 (D). * P & lt;. 0,05 en C, D
Derribo del receptor de leptina abroga DIO asociado el crecimiento del tumor
receptor de leptina se utilizaron células Panc02 desmontables para determinar si el tumor ortotópico de páncreas in vivo aumento crecimiento observado en los ratones obesos era debido al aumento de señalización de la leptina en ratones DIO. desmontables líneas celulares Panc02 receptor de leptina fueron inyectadas de forma ortotópica en los páncreas magra y DIO. Después de veinte y ocho días de crecimiento, los ratones se sacrificaron y se recogieron y se pesaron los tumores. Tanto de los receptores de leptina desmontables líneas mostraron una reducción pesos de los tumores en los ratones DIO, sin embargo, sólo LRKD2 mostró una disminución estadísticamente el peso del tumor en comparación con el control de las líneas de células shRNA Panc02 cultivadas en los ratones DIO (Fig 6A) parental o. tumores caída en ratones delgados no fueron significativamente diferentes entre sí. La proliferación de los tumores de LRKD2 se compararon con los tumores parentales para determinar el número de células positivas Ki67, que revelaron niveles similares de proliferación en los tumores de tipo salvaje DIO en comparación con los tumores DIO desmontables del receptor de leptina (Fig 6B). Por lo tanto, la diferencia en el crecimiento del tumor no se correlacionó con la proliferación de células tumorales.
Panc02 células con receptor de leptina desmontables variantes LRKD1 y LRKD2 fueron inyectadas de forma ortotópica en ratones delgados y DIO. (A) Las diferencias entre los padres (P), el control shRNA (C), y variantes desmontables no fueron estadísticamente diferentes cuando se hicieron comparaciones entre el control y los tumores en ratones delgados desmontables. receptor de la leptina variante desmontables LRKD2 mostró una disminución significativa del peso del tumor en ratones DIO en comparación con los tumores parentales y de control en ratones DIO. (ANOVA p & lt; 0,0001, * p & lt; 0,05). (B) Valoración de la proliferación de las células tumorales a través de la tinción de Ki67 no fue diferente entre los tumores DIO control en comparación con los tumores LRKD2 DIO, pero fue significativa entre los tumores delgados y DIO (ANOVA p & lt; 0,0004, * p & lt; 0,05).
Discusión
la obesidad y las alteraciones en la composición de la dieta se han reportado para afectar el crecimiento y la aparición de cánceres pancreáticos en múltiples modelos murinos [5, 6]. Este estudio demuestra que la dieta inducida por la obesidad se correlaciona con el desarrollo de un páncreas graso y que la obesidad potencia el crecimiento del cáncer de páncreas. obesidad inducida por la dieta se correlacionó con un aumento de la proliferación de las células tumorales pancreáticas ortotópicamente implantados
in vivo
. Además, la enfermedad del páncreas graso se demostró que se asocia con una mayor incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos [45]. Es importante destacar que algunos de los factores de riesgo mencionados asociados con el cáncer de páncreas son la obesidad, la pancreatitis crónica y diabetes [46]. Nuestros resultados son consistentes con el consenso general de que la obesidad es un factor que contribuye a un aumento del crecimiento del cáncer pancreático y ofrecer un mecanismo que contribuye para el crecimiento tumoral mejorada mediada por los cambios de leptina inducida en STAT3 y /o la señalización de PI3K-AKT.
Obesidad