Extracto
Fondo
La glucógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3) está implicado en el centro de diversos procesos celulares, incluyendo la proliferación y la apoptosis. Este estudio tuvo como objetivo investigar la influencia de la expresión GSK3 en el pronóstico de cáncer no microcítico de pulmón de células humanas (NSCLC) y los efectos de la inhibición de GSK3 en líneas celulares de cáncer.
Métodos
inmunohistoquímica y ensayos de Western blot se utilizaron para evaluar el nivel de expresión GSK3 en los tejidos humanos de NSCLC. Lentiviral interferencia de ARN se realizó para inhibir la expresión de GSK3 en la A549, H292, H1299 y SK-MES-1 líneas celulares. La supervivencia celular, se evaluó la apoptosis y la motilidad
in vivo
y en
in vitro
.
Resultados
Los niveles de GSK3 fueron mayores en los tejidos de NSCLC (n = 211) que en los tejidos de control (n = 194) (
P
& lt; 0,001). El análisis de seguimiento de 5 años demostró que la expresión de GSK3 positivo es indicativo de mal pronóstico (
P
= 0,006). Por otra parte, desmontables de GSK3 en líneas celulares de cáncer suprime la proliferación celular, detenido células tumorales en la fase G0 /G1, la apoptosis inducida y la reducción de la motilidad celular. Un modelo de xenoinjerto mostró que la desregulación de GSK3 atenúa la tumorigénesis, como se confirma por la proliferación celular reducida sobre la base de Ki-67 y aumentó significativamente la muerte celular por apoptosis. La inhibición de GSK3 tenía efectos inconsistentes sobre la expresión de β-catenina, dependiendo del tipo de células examinado.
Conclusión
expresión aberrante de GSK3 sirve como un marcador independiente de pronóstico pobre para NSCLC. La inhibición de GSK3 suprime la tumorigénesis mediante la atenuación de la proliferación celular, el aumento de la apoptosis y la restricción de la motilidad celular. Estos resultados identifican GSK3 como un promotor tumoral y una posible diana terapéutica en el CPNM
Visto:. Zeng J, Liu D, Qiu Z, Huang Y, Chen B, Wang L, et al. (2014) La sobreexpresión GSK3 Indica mal pronóstico y su inhibición reduce la proliferación celular y la supervivencia de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10.1371 /journal.pone.0091231
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Septiembre, 2013; Aceptado: 10 Febrero 2014; Publicado: 11 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Zeng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencia natural de China, (81201851 a Dan Liu Weimin y 81641028 a Li). La página web de la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China es http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón ha sido la causa principal de muertes en todo el mundo relacionadas con el cáncer durante décadas [1]. En China, el número de casos de cáncer de pulmón y muertes relacionadas con el cáncer de pulmón se han incrementado con el aumento de los niveles de abuso de cigarrillo y la contaminación [2]. El cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM), que incluye principalmente el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas, representa casi el 85% de los cánceres de pulmón. Aunque se han introducido nuevos enfoques terapéuticos, la mayoría de los pacientes están siendo diagnosticados en etapas avanzadas, y la tasa de supervivencia a 5 años sigue siendo inferior al 15% [1]. Para mejorar el resultado y la calidad de vida de los pacientes con CPNM, muchos estudios recientes se han centrado en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y la identificación de biomarcadores para facilitar el tratamiento individualizado [3].
La glucógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3) es una multifuncional serina /treonina proteína quinasa que originalmente fue aislado de músculo esquelético de conejo [4]. En condiciones de reposo, GSK3 es constitutivamente activa debido a la fosforilación de la tirosina-216, y se fosforila e inhibe un grupo diverso de sustratos pro-oncogénicas, tales como β-catenina, ciclina D1, c-Jun, c-Myc y CREB. A su vez, la fosforilación de la serina-9 inactiva GSK3 [5] - [7]. Sobre la base de estas funciones, GSK3 es un supresor de tumor potencial, y la inactivación de GSK3 se ha reportado en muchas células cancerosas [8], [9]. Sin embargo, muchos estudios han demostrado que la GSK3 puede regular positivamente la proliferación y la apoptosis de las células tumorales [10] - [18]. Además, los estudios han demostrado que la inhibición de GSK3 atenúa la supervivencia y la proliferación e induce la apoptosis en varios tipos de cáncer, como el cáncer de páncreas [11], el cáncer colorrectal [12], [15] y el cáncer de vejiga [18]. Sin embargo, el papel de la GSK3 difiere en diferentes tipos de cáncer [19], y el papel preciso de GSK3 en el CPNM sigue sin estar clara.
En este estudio, hemos explorado la expresión de GSK3 en los tejidos de NSCLC humanos y su importancia pronóstica. En el H292, H1299, SK-MES-1 y A549 líneas celulares de cáncer, la expresión de GSK3 fue inhibida por los pequeños ARN de horquilla (shRNA) transferidos por el vector lentiviral. líneas celulares estables desmontables fueron verificadas y utilizadas en futuras investigaciones. Tumorigénesis, la proliferación, la apoptosis y la migración celular también se evaluaron tanto
in vivo
y
in vitro
, y los resultados demostraron que la expresión aberrante de GSK3 sirve como un indicador independiente de mal pronóstico para el NSCLC. Por otra parte, la inhibición de GSK3 por ARN de interferencia suprime la tumorigénesis mediante la atenuación de la proliferación celular, el aumento de la apoptosis y la supresión de la invasión de células. En conjunto, estos hallazgos identifican GSK3 como un promotor tumoral y una posible diana terapéutica para el NSCLC.
Materiales y Métodos
1. Los pacientes y recogida de tejido
tejidos de NSCLC resecado quirúrgicamente (n = 211) y las muestras de pulmón normal adyacentes a los tejidos tumorales (n = 194) se obtuvieron del Hospital de China Occidental, la Universidad de Sichuan. Ninguno de los pacientes había sido tratado con cualquier quimioterapia preoperatoria o radioterapia. La información de seguimiento estaba disponible para 160 casos. Los estadios patológicos fueron determinados de acuerdo a la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) tumor-nódulo-metástasis del sistema de clasificación (TNM) para los tumores malignos. Para explorar más a fondo, se determinó el grado de diferenciación y el tipo histológico según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud para el NSCLC. Después de la resección quirúrgica, todos los pacientes recibieron tratamientos estándar de acuerdo con las Guías de Práctica Clínica en Oncología 2004 NCCN para el NSCLC. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente y de revisión institucional aprobación de la junta de este estudio se obtuvo de China Hospital West, la Universidad de Sichuan.
2. génica estable silenciar el uso de pequeños ARN de interferencia mediada por el vector lentiviral
El pulmón humano CPNM líneas celulares A549, H292, H1299 y SK-MES-1, que se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), se cultivaron de acuerdo con los protocolos ATCC
secuencias (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) dirigidos a GSK3 (número de acceso GenBank: NM_002093). que fueron diseñados utilizando el Diseñador BLOCK-iT ARN de interferencia (RNAi) (Invitrogen, Carlsbad, CA) fueron seleccionados. Una secuencia no relacionada con el gen de la GSK3 (TTCTCCGAACGTGTCACGT) fue diseñado como un control negativo (NC) [20]. El vector lentiviral pGCSIL-GFP fue adquirido de GeneChem y NeuronBiotech Corp (Shanghai, China). proteína verde fluorescente (GFP) se utilizó como marcador para observar y ordenar estas células tumorales transfectadas con células activadas por fluorescencia (FACS). Los efectos de la interferencia de ARN se evaluó mediante RT-PCR (en 5
TH días después de la transfección) y Western Blot (en 7
TH días después de la transfección). A continuación, las líneas celulares de cáncer con génica estable y sostenido GSK3 derribar se obtuvieron para más
in vivo
y
in vitro
estudios in. Las células infectadas con el lentivirus que dictó la secuencia dirigida GSK3 fueron nombrados como el grupo tumbar (KD grupo). Del mismo modo, las células que contienen el lentivirus-entregado la secuencia de NC fueron nombrados como el grupo NC; y estas células tumorales no infectadas por lentivirus se utilizaron como control normal y nombrados como el grupo de control (grupo CON).
3. Tumorigénesis en ratones xenoinjertados
ratones desnudos (BALB /c-nu /nu, n = 6 para cada grupo, igual número de machos y hembras, de 6-8 semanas de edad) fueron suministrados por el Centro de Animales de Laboratorio de Sichuan Universidad. Los animales fueron alojados en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos y ad libitum. Se llevaron a cabo todos los estudios con ratones de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Aprobación de este estudio fue dado por el Comité de Atención y Tratamiento de Animales Institucional de la Universidad de Sichuan.
Tras el tratamiento con diferentes virus, que crecen exponencialmente células A549 fueron inyectados por vía subcutánea en el dorso de ratones Balb /c ratones nude (1 × 10
6 /ml cada una). Los volúmenes de los tumores se evaluaron cada 3 días de acuerdo con la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = d
2 × D × 0,52. Cuatro semanas después de la implantación del tumor, los ratones se sacrificaron sin dolor. Sus órganos fueron examinados para pruebas bruto de cambios anatómicos.
4. Ensayos de proliferación celular
El Recuento celular Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Rockville, EE.UU.) se utilizó para evaluar la proliferación celular de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células tumorales (2 × 10
3 por pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos, y se trataron con 10% de FBS y se incubaron a 37 ° C. La densidad óptica a 450 nm se midió a 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la transfección virus. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes y se presentan como la media ± S. D.
5. Análisis del ciclo celular
Setenta y dos horas después de la transfección, los datos del ciclo celular se obtuvieron mediante el análisis de las células PI-teñidas utilizando células activadas por fluorescencia (FACS) con un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU. ). Para cada muestra, al menos 3 × 10
se contaron 5 células, y los datos se analizaron con el software CellQuest BD. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes y se presentan como la media ± S. D.
6. análisis Apoptosis
Las células tumorales (aproximadamente 5 × 10
5) se tiñeron con 5 l de anexina V-APC y 7AAD (KeyGen, Nanjing, China) a temperatura ambiente y después se analizaron por citometría de flujo dentro de 1 marido. La Anexina V (+) /7AAD (-). Las células fueron considerados como células apoptóticas
Se utilizó el método TUNEL (In Situ Cell Death Kit de detección de AP, Roche, Suiza) para determinar el nivel de la apoptosis en xenoinjertos tejidos tumorales. Se detectaron células apoptóticas usando fosfatasa alcalina y se tiñeron de rojo. Para cada tumor, se contaron las células apoptóticas en 5 campos de alta potencia al azar, y la tasa de apoptosis se calculó con la siguiente fórmula:
tasa de apoptosis = número de células apoptóticas /número total de células tumorales contó × 100 %.
7. La extracción de RNA y PCR en tiempo real
Los cebadores para GSK3 humana fueron 5'-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 '(sentido) y 5'-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3' (antisentido); y aquellos para GAPDH eran 5 'CCATCACCATCTTCCAGG-3' (sentido) y 5 'ATGAGTCCTTCCACGATAC -3' (antisentido). Los cebadores y sondas fueron adquiridos de GeneChem, Shanghai, China. Los niveles de expresión de ARNm se cuantificaron por triplicado por tiempo real RT-PCR utilizando un termociclador 2720 (Applied Biosystems, Foster City, California). Los niveles relativos de transcritos diana se cuantificaron utilizando el método 2 (-Delta Delta Ct) [21] y se normalizó al nivel de transcritos de GAPDH humanos.
8. la invasión de células de ensayo
La invasión celular Kit de ensayo (ECM550, Chemicon, California, EE.UU.) se utilizó para evaluar la invasividad celular. Después de la transfección virus, una parte alícuota de la suspensión celular preparada (300 l, 1,0 × 10
6 células /ml) se añadió a cada inserto superior. Después de 48 h de incubación, los insertos se sumergieron en solución de tinción durante 20 minutos para teñir las células invasoras en la membrana. A continuación, se contaron las células invasoras en 5 vistas de microscopio aleatorios. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes y se presentan como la media ± S. D.
9. El análisis de Western Blot
Las proteínas totales se extrajeron de los tejidos tumorales de NSCLC y se transfectaron células cultivadas y luego clasificaron utilizando un kit de extracción de proteínas (keygen, Nanjing, China) y el reactivo de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.) . Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se visualizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos para GSK3 (# 9315, diluido 1: 400) y β-catenina (# 9582, diluido 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, EE.UU.). Después de la exposición a un sustrato quimioluminiscente de HRP (Millipore, Billerica, EE.UU.), las proteínas diana se detectaron usando un sistema de ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Philadelphia, EE.UU.), y las imágenes se analizaron con software Gel-Pro Analizador 4,0 (cibernética medios ).
10. ensayo inmunohistoquímico
GSK3 en los tejidos tumorales de NSCLC y los tejidos normales adyacentes con tinción inmunohistoquímica fue como se describe en nuestros estudios anteriores [22] - [24]. Evaluación semicuantitativa de las secciones se realizó por 2 patólogos en una forma ciega. El control negativo para la inmunotinción se realizó sin el anticuerpo primario. Tanto la fracción y la intensidad de las células tumorales immunostained se consideraron. La puntuación fracción se calcula como el promedio de 5 campos de alta potencia seleccionados al azar evaluada por microscopía de luz de la siguiente manera: 0, no hay células objetivo marcadas (tumor, bronquial o células alveolares); 1, & lt; 20% de células teñidas; 2, 20~50% de células teñidas; y 3, más del 50% de células teñidas. La puntuación de la intensidad se define como sigue: 0, ninguna tinción apreciable de las células diana; 1, apenas tinción detectable en el citoplasma y /o núcleo de las células diana; 2, la tinción marrón fácilmente evidente; y 3, la tinción de color marrón oscuro. Las puntuaciones de intensidad de fracciones y se multiplicaron para dar una puntuación total que varía de 0 a 9. Las puntuaciones entre 2 y 9 fueron considerados como expresión positiva. Los ensayos inmunohistoquímicos se realizaron en secciones histológicas de los tumores de xenoinjertos embebidos en parafina.
tinción del marcador de proliferación Ki-67 se realizó para evaluar el crecimiento de los tumores de xenoinjertos. El anticuerpo Ki-67 (# MA1-80199, diluido 1: 100) se obtuvo de Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.. El índice de marcaje Ki-67 (Ki-67 LI) se calculó según la siguiente fórmula:
Ki-67 LI = número de Ki-67 células positivas /número total de células tumorales contados × 100%
11. El análisis estadístico
SPSS 17.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis de datos. Los resultados de inmunohistoquímica y sus asociaciones con las características clínicas se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. Se utilizó la prueba de rangos de Spearman para analizar la correlación entre los fenotipos de proteínas. El método de Kaplan-Meier se utilizó para analizar la supervivencia univariante y comparaciones de las distribuciones de supervivencia entre los grupos se realizaron mediante la prueba de log-rank. La importancia pronóstica de la expresión de GSK3 con respecto a otras variables patológicas se evaluó mediante análisis de regresión de Cox. Los datos cuantitativos se expresan como la media ± S. D. La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó por ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc PLSD de Fisher. Todos los
P
valores fueron de 2 colas, y los valores de
P Hotel & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
1. GSK3 está regulada positivamente en los tejidos tumorales de NSCLC
Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica para GSK3 en los tejidos de NSCLC y los tejidos normales correspondientes se muestran en la Figura 1A. GSK3 se expresa prominentemente en NSCLC (n = 211), principalmente en el citoplasma de las células tumorales. Las comparaciones de los niveles de proteína GSK3 entre el tumor y los tejidos pulmonares normales se muestran en la Tabla 1. Los resultados demostraron que el nivel de GSK3 fue significativamente mayor en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos pulmonares normales (
P
& lt; 0,001). Los ensayos de transferencia de Western también confirmaron que el nivel de expresión de GSK3 en los tumores fue mayor que en sus homólogos normales. (
P
= 0,04, Figura 1B).
(A) típicas imágenes de tinción IHC de tumor de NSCLC humano y el tejido pulmonar normal (aumento x 200). (B) ensayos de transferencia de Western confirmó que en los tejidos normales /tumorales emparejadas de pacientes con cáncer de NSCLC, más altos niveles de expresión de GSK3 en los tumores se encontraron en comparación con sus homólogos normales. Los experimentos se repitieron 3 veces, y los datos se presentan como la media ± SD. *
P Hotel & lt; 0,001. (C) la glucógeno sintasa fosforilada (PGS), un sustrato de GSK3, se detectó en estas líneas celulares de cáncer, a excepción de H292.
Como sustrato de GSK3, la expresión de la proteína de fosforilados la glucógeno sintasa (PGs) se utiliza para indicar la actividad de GSK3. En estas líneas celulares 4, excepto en H292 PGS, se detectó (Figura 1C), lo que sugiere una alta actividad de GSK3 en el cáncer de pulmón humano.
2. expresión positiva de GSK3 se asocia con un mal pronóstico para el NSCLC
Los pacientes con información clínica completa (160 casos, 39 mujeres y 121 hombres, 61,19 ± 10,53 años) fueron incluidos en el análisis de supervivencia. La edad media fue de 60,00 años (rango, 29 a 83 años). Las características clínicas y los resultados de análisis de supervivencia se resumen en la Tabla 2 y la Figura 2. La tasa de supervivencia a 5 años para todo el grupo fue 49,07%, y la mediana del tiempo de seguimiento fue de 58,00 meses (rango, 0 a 77,67 meses).
(A) En todo el grupo, los pacientes con expresión de GSK3 positivo tenían tiempos de supervivencia más cortos,
P = 0,006
. Figura 2B-D muestra el análisis de supervivencia para los subgrupos. (B) En el subgrupo menor diferenciación, los pacientes con expresión de GSK3 positivo tenía supervivencia significativamente más corta,
P = 0,013
. (C) En el T1 + T2 subgrupos, los pacientes con expresión de GSK3 positivo tenía supervivencia significativamente más corta,
P = 0,003
. (D) En el subgrupo N0 + N1, los pacientes con expresión de GSK3 positivo tenía supervivencia significativamente más corta,
P = 0,010
. (E) Los pacientes en el subgrupo M0 con la expresión de GSK3 positivos tenían significativamente más cortos tiempos de supervivencia,
P = 0,008
. Las curvas de Kaplan-Meier para las proteínas investigadas fueron utilizados para comparar los terminales positivo (
líneas discontinuas) y fenotipos negativos (
líneas continuas).
se realizó un análisis univariado para estimar la relación entre las características clínicas y la expresión de GSK3. Como se muestra en la Tabla 2, los pacientes con CPNM con diferentes características clínicas, tales como sexo, edad, tipo histológico y el estadio del tumor-nódulo-metástasis (TNM), demostraron niveles similares de GSK3. La importancia pronóstica de la expresión positiva GSK3 en diferentes subgrupos se evaluó mediante la prueba de log-rank. En todo el grupo, los pacientes con expresión de GSK3 positivo tenían tiempos de supervivencia más cortos (
P = 0,006
, Figura 2A). Los resultados también indican que el sexo masculino, la edad avanzada y el cáncer de células escamosas (SCC) con la expresión de GSK3 positivos se asociaron con un peor pronóstico (
P = 0,019
,
P = 0,020
y
P = 0,002
, respectivamente). Además, los pacientes con CPNM con tumores poco diferenciados o en los subgrupos etapa relativamente temprana (T1 + T2, N0 M0 + N1 y) con la expresión de GSK3 positivos tenían significativamente más cortos tiempos de supervivencia (
P = 0,013
,
P
= 0,003,
P = 0,010
y
P = 0,008
, respectivamente;. se muestra en la Figura 2B-e)
por otra parte, el análisis de regresión de Cox multivariado reveló que en este grupo, el tamaño del tumor, invasión ganglionar y la expresión de GSK3 fueron predictores independientes de NSCLC pronóstico. Estos resultados sugieren que GSK3 juega un papel importante en la tumorigénesis y NSCLC impulsaron su posterior análisis.
3. GSK3 regula positivamente la proliferación de células tumorales y la supervivencia en NSCLC
Un vector lentiviral se utiliza para transferir shRNAs diseñados dirigidos GSK3 en estas 4 líneas celulares de cáncer de manera persistente silenciar su expresión. Los efectos de la interferencia de ARN se evaluaron mediante RT-PCR (5 días después de la transfección) y transferencia Western (7 días después de la transfección). Estos resultados demostraron que los niveles de ARN y de proteína de GSK3 en las células tumorales de las 4 líneas de células examinadas se redujeron significativamente, como se muestra en la Figura 3A-B (todo
P
& lt; 0,001). Por otra parte, los tejidos xenoinjertos aisladas a partir de ratones desnudos fueron inmunohistoquímicamente manchado, y los resultados verificaron la reducción sostenida estable en los niveles de GSK3 después de la interferencia de ARN (Figura 3C). Estos resultados indican que GSK3 era eficaz y estable derribado por el shRNA en todas las 4 líneas celulares de NSCLC.
(A) shRNAs GSK3-específicos se transfectaron en células de NSCLC con vector lentiviral, y se recogieron las células y se contaron 5 días después de la transfección. PCR en tiempo real indica que la interferencia por shRNA efectivamente asoló la expresión del ARNm de GSK3 en las células NSCLC. (B) Las células se recogieron y se contaron 7 días después de la transfección. transferencia de Western muestra la eficiencia del silenciamiento de proteínas por shRNA. (C) Después del tratamiento con la GSK3 shRNA (grupo KD), el control negativo shRNA (grupo NC) o solución salina (grupo CON) normales, las células A549 (1 × 10
6 /ml) se inyectaron en la espalda de ratones desnudos. Cuatro semanas más tarde, los xenoinjertos de tumores fueron aislados e inmunohistoquímico manchado. Los resultados verificaron los niveles reducidos sostenidos de GSK3 en el grupo KD en relación con los grupos de control. Las flechas indican la tinción positiva en el citoplasma de las células tumorales (aumento x 400). Los experimentos se repitieron 3 veces, y los datos se expresan como la media ± SD. *
P
. & Lt; 0,001
El ensayo de CCK-8 demuestra que la caída de GSK3 suprime claramente la viabilidad de las 4 líneas celulares (todos los
P
& lt; 0,001, Figura 4A). En el
in vivo
estudio utilizando ratones de xenoinjerto, los tumores en el grupo KD crecieron significativamente más lentamente y tenía volúmenes de los tumores más bajos durante todo el período de 4 semanas (
P = 0,001
, la figura 4B ). Al final del período de observación, los pesos de los xenoinjertos en el grupo KD eran mucho más bajos que los de los grupos de control (
P
= 0,001, Figura 4C). Además, el Ki-67 LI de los xenoinjertos se redujo drásticamente en el grupo KD en comparación con los de los grupos NC y CON (38,98% frente a 75,14% vs. 73,84%,
P
& lt; 0,001, Figura 4D), lo que indica que la regulación a la baja de GSK3 inhibe la proliferación celular
in vivo
. Estos resultados sugieren que la GSK3 regula positivamente el crecimiento y la tumorigénesis de células de NSCLC, y el próximo tratado de abordar cómo se mediada estos efectos.
(A) La prueba de CCK-8 mostró que la inhibición de GSK3 suprime la proliferación de las líneas celulares de cáncer
in vitro
. *
P Hotel & lt; 0,001. (B)
In vivo
: Como se describe en la Figura 3C, los modelos de xenoinjerto se desarrollaron en ratones desnudos. Cada grupo constaba de 6 animales. Los tumores se observaron cada 3 días durante 4 semanas. Los tumores de xenoinjerto de ratones en el grupo KD crecieron significativamente más lento (como se determina por el volumen del tumor) durante todo el período de observación. *
P Hotel & lt; 0,001. (C) Comparación de los tumores de xenoinjertos aisladas. La imagen muestra que los tumores aislados del grupo KD eran más pequeños y más ligeros que los tumores del grupo de control. Los datos se expresan como la media ± SD, n = 6. *
P
& lt; 0,001. (D) imagen representativa de Ki-67 IHC de un xenoinjerto de tumor se observa bajo un microscopio. Para calcular el Ki-67 LI, las células con núcleos teñidos de color marrón se consideraron positivos, lo que indica la proliferación activa (aumento x 400). Los datos se expresan como la media ± SD, *
P
& lt; 0,001. análisis (E) del ciclo celular a las 72 h después de la transfección. Los resultados sugieren que la inhibición de GSK3 resultó en G1 /S detención en A549 y SK-MES-1 en las células y se cambió la proporción de la población de células en diferentes fases del ciclo celular. Los datos se presentan como la media ± S.D. de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,001. (F) por citometría de flujo, los resultados del análisis de apoptosis indica que la inhibición de GSK3 aumenta en gran medida la tasa de apoptosis de células de NSCLC (excepto para las células A549)
in vitro
. *
P Hotel & lt; 0,001, ▴
P Hotel & gt; 0,05. (G) Los resultados del ensayo de TUNEL para los tumores de xenoinjerto sugiere que la inhibición de GSK3 aumenta la tasa de apoptosis de las células A549
in vivo
(aumento x 400). Los datos se expresan como la media ± SD, *
P
& lt; 0,001. ensayos (H) Transwell que muestra que la inhibición de GSK3
in vitro
disminuido significativamente la invasividad de células de NSCLC. Los datos se expresan como la media ± S.D. *
P
. & Lt; 0,001
Después de realizar el análisis del ciclo celular por citometría de flujo, se encontró que la inhibición de GSK3 aumentó el número de células en la fase G0 /G1 y la disminución de la cantidad de células en fase S en el A549 (
P = 0,003
, y
P Hotel & lt; 0,001) y las células SK-MES-1 (
P = 0,002
,
P = 0,022
) (Figura 4E). En las células H1299 y H292, GSK3 desmontables dio lugar a una tendencia hacia un aumento de la población G0 /G1, pero las diferencias no alcanzaron significación estadística (en las células H1299,
P = 0,056
; y en células H292,
P = 0,216
).
in vitro
, el ensayo de apoptosis de las células sugiere que las tasas de apoptosis en el grupo KD era enormemente superiores a los de los grupos de control, con la excepción de la línea celular A549 (H292, H1299 y SK-MES-1, todos los
P & lt; 0,001
; A549,
P = 0,461
, Figura 4F). Para los ratones de xenoinjerto, el ensayo TUNEL reveló que la tasa de apoptosis en el grupo KD (3,06% ± 1,24%) fue mucho mayor que las de los otros grupos (grupo NC, 0,11% ± 0,04%; y el grupo CON, 0,46% ± 0,23%) (
P Hotel & lt; 0,001). Como se muestra en la Figura 4G, las células apoptóticas se tiñeron de color rojo y encogido. En conjunto, estos resultados sugieren que la inhibición de GSK3 indujo apoptosis de las células NSCLC.
4. La inhibición de GSK3 reduce la invasividad de las células de NSCLC
Para contar las células migradas
in vitro
, el ensayo transwell con células de NSCLC se repitió 3 veces, y los resultados se muestran en la Figura 4H. Para todas las 4 líneas celulares, el grupo KD demostró significativamente menos células invasoras (todo
P & lt; 0,001
), lo que sugiere que la inhibición de GSK3 suprime en gran medida la capacidad de invasión de células de NSCLC. En los ratones de xenoinjerto, no se encontraron metástasis después de una inspección y palpación bruto. Además, el análisis de microscopía óptica reveló ninguna evidencia de focos metastásicos en los órganos fijados y teñidos.
Expresión
5.β-catenina después de la inhibición de GSK3
Como se muestra en la Figura 5, la expresión nivel de β-catenina, fue significativamente superior en el grupo KD de la línea de células escamosas SK-MES (
P Hotel & lt; 0,001). Por otra parte, desmontables de GSK3 suprime en gran medida la expresión de β-catenina en células H1299 (
P
& lt; 0,001) pero no en H292 (
P
= 0,108) o A549 células (
P
= 0,185).
(a) bandas típicos en el ensayo de transferencia Western mostró que los niveles de proteína beta-catenina se regulan de una manera específica del tipo de célula después de la inhibición de la GSK3. (B) Análisis cuantitativo de la expresión de β-catenina. El experimento se repitió 3 veces, y los datos se expresan como la media ± SD. *
P
. & Lt; 0,001
Discusión
GSK3 se identificó originalmente como una enzima reguladora principal del metabolismo del glucógeno [4], [7]. Desde entonces, esta proteína se ha encontrado que es un importante regulador de la supervivencia celular y la apoptosis, que conecta esta quinasa multifuncional para el cáncer [25], [26]. Recientemente, un número de estudios han demostrado que la GSK3 puede regular positivamente la proliferación y la apoptosis de las células tumorales [10] - [18], aunque el papel preciso de GSK3 en el cáncer de pulmón sigue siendo desconocido. Por lo tanto, el presente estudio exploró la importancia pronóstica de GSK3 y su función en el CPNM
.
En primer lugar, se observó que la sobreexpresión de GSK3 en los tejidos de NSCLC al comparar los tejidos de NSCLC con los tejidos normales adyacentes, y esto de una acumulación anormal de GSK3 en células de NSCLC se asoció con un tiempo de supervivencia más corta y se identificaron como un nuevo factor de riesgo de mal pronóstico. Aunque poco se ha prestado atención a la expresión de GSK3 en el cáncer de pulmón, la evidencia sugiere que la sobreexpresión de p-GSK3 puede servir como un marcador de peor pronóstico en el cáncer de pulmón [27]. Debido a p-GSK3 es la forma inactiva de GSK3, la sobreexpresión de p-GSK3 no es necesariamente equivalente a la pérdida de GSK3, especialmente cuando el nivel de proteína total también está regulada positivamente en gran medida. En nuestro estudio, las altas expresiones de PGS, que es un indicador de la actividad de GSK3, se detectó en la mayoría de líneas celulares de NSCLC, lo que indica que GSK3 es muy activo en las células de NSCLC. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que la sobreexpresión del total de GSK3 se sobre-activa y confiere un mal pronóstico en pacientes con CPNM. Se han notificado resultados similares para el cáncer de vejiga [18]. Por lo tanto, la sobreexpresión GSK3 puede servir como un biomarcador para mejorar el diagnóstico precoz, la selección de pacientes y la determinación del pronóstico.
En voluminoso, nuestros resultados mostraron que IHC GSK3 se localiza predominantemente en el citoplasma de paciente y del tumor de xenoinjerto de tejidos. Por el contrario, varios estudios han demostrado que GSK3 se acumula en el núcleo en páncreas [11], renales tipos de cáncer [28] y de la vejiga [18]. En estos tejidos tumorales, GSK3 nucleares podrían desempeñar un papel en la NF-kappa B mediada por la supervivencia de células de cáncer; sin embargo, después desmontables de GSK3, los niveles de expresión de NF-kB en las diferentes líneas celulares de cáncer de nuestro estudio eran incompatibles, lo que indica que GSK3 puede mediar la supervivencia de células de cáncer independiente de la expresión de NFkB (datos no mostrados). Por lo tanto, la localización subcelular de GSK3 es complejo y estrechamente relacionado con su mecanismo molecular. El estudio adicional sobre el papel localización subcelular de GSK3 debe llevarse a cabo.
La siguiente pregunta importante es cómo explicar la profunda influencia de GSK3 en el pronóstico de los pacientes con CPNM. Este estudio tuvo como objetivo investigar los mecanismos moleculares básicos de GSK3
in vitro
y
in vivo
. Ha sido bien establecido que GSK3 juega un papel central en la regulación de la apoptosis [26]. Por ejemplo, GSK3 knockout o tratamiento de litio potencia la apoptosis en hepatocitos [29], y un aumento de la tasa de apoptosis después de la inhibición de GSK3 se ha descrito en el cáncer de próstata [30], cáncer de páncreas [11], leucemia [13], glioma [ ,,,0],17] y el cáncer de vejiga [18].