Extracto
Antecedentes
activación aberrante de la vía canónica de Wnt /β- catenina se produce en casi todos los cánceres colorrectales y contribuye a su crecimiento, invasión y supervivencia. Fosfolipasa D (PLD) ha sido implicado en la progresión del carcinoma colorrectal Sin embargo, una comprensión de los objetivos y la regulación de esta importante vía permanece incompleta y, además, la relación entre la señalización de Wnt y PLD no se conoce.
Metodología /Principales hallazgos
A continuación, se demuestra que las isoenzimas del PLD, PLD1 y PLD2 son objetivos directos y los reguladores de retroalimentación positiva de la señalización /β-catenina vía. Wnt3a y Wnt miméticos de mejora de forma significativa la expresión de PLDs a nivel transcripcional en células de cáncer colorrectal HCT116, mientras que el silenciamiento de la expresión génica β-catenina o la utilización de una forma dominante negativa de células T factor de 4 (TCF-4) inhibió la expresión de PLDs . Por otra parte, tanto PLD1 y PLD2 fueron altamente inducidas en los tejidos del colon, hígado y estómago de ratones tras la inyección de LiCl, un mimético de Wnt. Wnt3a estimuló la formación de los complejos de β-catenina /TCF a dos elementos TCF-4-unión funcional dentro del promotor PLD2 tal como se evaluó mediante el ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina. La supresión de PLD mediante el silenciamiento de genes o inhibidor selectivo bloqueaba la capacidad de β-catenina a transcripcionalmente active PLD y otros destinatarios genes Wnt mediante la prevención de la formación de la β-catenina /complejo TCF-4, mientras que las tácticas para elevar los niveles intracelulares de ácido fosfatídico, el producto de la actividad de PLD, el aumento de estos efectos. Aquí nos muestran que el PLD es necesaria para el crecimiento y la invasión de anclaje independiente impulsado por Wnt3a de células de cáncer de colon.
Conclusión /Importancia
PLD isoenzimas actúa como un objetivo transcripcional novela y el regulador de retroalimentación positiva señalización de Wnt, y luego promueve impulsado por Wnt crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer colorrectal. Proponemos que las intervenciones terapéuticas dirigidas PLD pueden conferir un beneficio clínico en tumores malignos /β-catenina impulsada por Wnt
Visto:. Kang DW, DS Min (2010) Positivo regulación de la retroalimentación entre la fosfolipasa D y la señalización Wnt Promueve Wnt impulsado anclaje independiente de crecimiento de células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10.1371 /journal.pone.0012109
Editor: Sudha Agarwal, de la Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril 2010; Aceptado: July 5, 2010; Publicado: 12 Agosto, 2010
Derechos de Autor © 2010 Kang, Min. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Corea del Healthcare Technology R & amp; D Proyecto, Ministerio de Sanidad, Bienestar Social y Asuntos de la Familia, República de Corea (A080287). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es una de las enfermedades más comunes, que ocurren en un porcentaje significativo de la población. Más de 80% de los cánceres colorrectales esporádicos y hereditarios pueden ser causados por aberraciones en la vía de señalización Wnt /β-catenina [1] - [3]. Por lo tanto, alteraciones en la vía /β-catenina Wnt definen un evento clave en la patogénesis del cáncer de colon. β-catenina es un coactivador transcripcional del factor de células T (TCF) /factor de linfoide potenciador (ABL) factores de transcripción. β-catenina estabilidad está regulada por un complejo multiproteico que incluye la poliposis adenomatosa coli (APC), la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3), y axina. La fosforilación de β-catenina por GSK3 se dirige a β-catenina a la ubiquitinación y la degradación del proteasoma [4]. Así, la activación de la vía de degradación reprime β-catenina, lo que resulta en la acumulación nuclear de β-catenina. En el núcleo, la acumulación de TCF /β-catenina conduce a la activación transcripcional de varios genes diana, lo que puede contribuir al desarrollo de cáncer [5], [6]. Por lo tanto, la identificación de blancos directos de la vía de señalización /β-catenina es potencialmente importante para entender el papel central de la Wnt /β-catenina /TCF vía canónica dependiente en la tumorigénesis.
La fosfolipasa D (PLD) cataliza hidrólisis de la fosfatidilcolina (PC) para generar el ácido fosfatídico (PA), que actúa como un segundo mensajero en muchas respuestas fisiológicas [7]. Dos isoenzimas PLD-PC específica de mamíferos designados como PLD1 y PLD2 han sido clonados. PLD ha surgido como un regulador crítico de la proliferación celular y la supervivencia cuya desregulación se produce durante el desarrollo de una variedad de tumores humanos [8]. La expresión elevada de PLD1 y PLD2 ha informado en tejidos de cáncer colorrectal [9]; en particular, el nivel de expresión PLD2 y su asociación con características clinicopatológicas recientemente se han investigado en carcinoma colorrectal [10]. Los niveles de expresión de PLD2 se correlacionan significativamente con el tamaño del tumor y la supervivencia de los pacientes con carcinoma colorrectal [10]. La mutación puntual PLD2 también se ha encontrado en el cáncer de mama [11]. Las células que sobreexpresan PLD isoenzima mejorar la matriz metaloproteinasa-2 de expresión y la invasión de células tumorales y formar metástasis en ratones singénicos [12], [13]. Estos hallazgos sugieren que PLD juega un papel importante en la progresión del carcinoma colorrectal, y podría ser un objetivo para la terapia del cáncer. Recientemente hemos informado de importantes co-sobreexpresión de PLD isoenzimas con β-catenina en el cáncer colorrectal humano [14]. El uso de dos ARN de interferencia (ARNi) a base de pantallas de la pérdida de la función, los oncogenes que modulan la β-catenina que dependen de la transcripción y regulan la proliferación de células de cáncer de colon se han identificado [15].
Entre uno de los genes identificado en esta pantalla era PLD1, y la supresión de PLD1 inhibió significativamente β-catenina tanto la proliferación actividad y cáncer de colon de la transcripción celular. En el presente estudio, se demuestra la acción del PLD isoenzimas como nuevas dianas y reguladores de retroalimentación positiva de la señalización de Wnt. Por lo tanto, la identificación de un eje PLD regulado por Wnt-β-catenina-TCF proporciona nuevos conocimientos sobre mecánica en cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
colorrectal humano células cancerosas (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO) y las células de cáncer de mama (HS578T) se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con protocolos estándar. Purificada Wnt3a recombinante se adquirió de amp I +; D Systems Inc. BIO se obtuvo de Calbiochem. LiCl, 1- o 3-butanol, dioctanoilo PA, y 1-propranolol se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los inhibidores selectivos de PLD1 y PLD2 fueron adquiridos de química Caimán. kits de ensayo de luciferasa dual se adquirieron de Promega.
Los plásmidos y pequeños ARN de interferencia
PLD1 Humano (pGL4-Luc PLD1) y PLD2 (pGL4-PLD2 Luc) reportero plásmidos contienen el promotor -1,9 kb ( -1930 /+ 1) y 2,6 kb (-2180 /+ 491) de aguas arriba de ADN flanqueante 5 'ligado a genes informadores de luciferasa, respectivamente, y se han descrito en otra parte [14]. Se utilizó el promotor de hPLD1 (pGL4-PLD1; -1930 /+ 1), que se transcribe desde el exón 2, entre dos transcritos alternativos de PLD1 que se transcribe en dos sitios de transcripción diferentes (exón 1 y el exón 2). El método basado en la PCR se utilizó para la clonación de promotor PLD2 en serie borrado construye en el vector reportero pGL4-14b en el sitio Kpn I y Bgl II. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores en la PCR amplificaciones se muestra en la Tabla S1.
Las mutaciones de TCF-4 elementos de unión en el promotor PLD2 se generaron usando el kit de mutagénesis Quick Change Site-Directed, de acuerdo con el fabricante de recomendaciones (Stratagene; Tabla S2). TOPflash y FOPFLASH plásmidos de luciferasa que contienen múltiples copias de los elementos de respuesta TCF /LEF se utilizaron para la medición de la actividad TCF. Dominante negativo TCF-4 (ΔN30 TCF-4) fue proporcionado amablemente por el Dr. Tesshi Yamada (Instituto Nacional Centro de Investigación del Cáncer). constitutiva mutante activo de β-catenina (S37A β-catenina) y de tipo salvaje vectores de expresión de TCF-4 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Bert Vogelstein (Universidad Johns Hopkins). shRNA de β-catenina fue proporcionado amablemente por el Dr. H. Clevers (Utrecht,. Países Bajos). SiRNAs para el control, PLD1, y PLD2 fueron adquiridos de Dharmacon Research Inc (Lafayette, Colorado). secuencias de siRNA para PLD son los siguientes:. PLD1 humana (nucleótidos 1571 a 1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) y PLD2 humanos (nucleótidos 1378 a 1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA)
transfección transitoria y gen reportero de ensayo
siguiendo las instrucciones, los plásmidos de expresión de siRNA o del fabricante fueron transfectadas transitoriamente en las células usando reactivos Polyfect (Qiagen) LipofectAmina Plus (Invitrogen) o. Se llevaron a cabo ensayos de transfección y luciferasa como se describe anteriormente [16]. la actividad de luciferasa relativa se obtuvo por la normalización de la actividad de la luciferasa de luciérnaga contra la actividad del control interno
renilla luciferasa
.
inmunoprecipitación y Western Blotting
Los lisados celulares se analizaron por inmunoprecipitación y /o inmunotransferencia, tal como se describe anteriormente [17]. Anti-α-tubulina (Sigma, MO), anti-vimentina (Sigma, MO), anti-c-Myc (Santa Cruz, CA), anti-β-catenina (Santa Cruz, CA), anti-NOS2 (Santa Cruz , CA), anti-TCF-4 (Santa Cruz, CA), anti-β-catenina (BD Biosciences, CA), anti-cycinD1 (BD Biosciences, CA), y el anticuerpo-GSK3 anti-fosfo (señalización celular, MA ) fueron comprados. El anticuerpo policlonal anti-PLD que reconoce tanto PLD1 y PLD2 se generó como se describe anteriormente [18].
actividad PLD ensayo
actividad PLD se evaluó mediante la medición de la formación de [
3H] phosphatidylbutanol, el producto de transfosfatidilación mediada por PLD, en presencia de 1-butanol, como se describe anteriormente [17].
RT-PCR cuantitativa
el ARN total (1 g) fue pretratado con DNasa y se utiliza para la transcripción inversa con M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen). En tiempo real Q-PCR se realizó en un aparato de RG-6000A Rotor-Gene (Corbett Research): para 44 ciclos de 94 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 10 seg, y 72 ° C durante 15 s. Reacciones (20 l) incluyen 2 l de ADNc, cebadores específicos de la diana, y el kit de PCR SYBR verde Quantitect (QIAGEN). El rango de temperatura para el análisis de curvas de fusión fue de 55 ° C a 99 ° C durante 30 s. Tres experimentos independientes se realizaron para cada reacción por triplicado. Todos los datos se normalizaron con los valores de expresión de genes GAPDH. Véase la Tabla S3 para las secuencias de cebadores Q-RT-PCR.
Animales y preparación de tejidos
Los ratones fueron provistos de mantenimiento estándar y una dieta de Dae Han Bio Link (Seúl, Corea). Los estudios en animales se aprobaron y se llevaron a cabo bajo las directrices del Instituto de Salud directrices para la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional de Pusan (Busan, Corea). Doce ratones FVB macho semanas de edad recibieron una inyección intravenosa con LiCl una vez al día durante 2 días a dosis de 5 mg /kg. El grupo de control se inyectó con el mismo volumen de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Cuarenta y ocho horas después de la inyección de LiCl, los animales (n = 3 /grupo) fueron profundamente anestesiados con éter dietílico y decapitados, y los tejidos se congelaron inmediatamente en LN
2 y se almacenaron a -70 ° C para inmunotransferencia. Los ratones (n = 3 /grupo) también fueron anestesiados y perfundidos por vía intracardiaca con 4% de paraformaldehído en PBS que contenía 0,34% de L-lisina (Sigma). Después de la perfusión fijador, se eliminaron los tejidos, se colocó en solución de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche, y después se transfirió a una solución de sacarosa al 30%. Los tejidos fueron procesados por criostato coronal seccionamiento en solución de PBS de Dulbecco que contenía azida sódica al 0,1% usando un micrótomo de congelación (MICROM, Alemania).
Inmunohistoquímica
4 micras secciones de parafina paraformaldehído fijo de tejidos de colon se trataron en autoclave en tampón citrato de sodio 10 mM (pH 6,0). Después de bloquear con BSA al 5% y 1% de suero normal de cabra en PBS, las secciones se incubaron con anti-β-catenina (BD transducción) y anticuerpos PLD durante la noche a 4 ° C, seguido de lavado con PBS. Posteriormente, las secciones se incubaron con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555 conjugado con anticuerpo secundario IgG (Santa cruz, 1: 200) a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de lavado con PBS. Después counterstaing con DAPI, y el portaobjetos se montaron en Permount
® (Fisher Scientific, EE.UU.). imagen fluorescente de dos colores para el anti-PLD y la tinción de anticuerpos β-catenina se recogieron en un Zeiss LSM 510 microscopio confocal (Zeiss, Alemania). Fluorescente imágenes fueron analizados utilizando el software Zeiss LSM navegador de imágenes (Zeiss).
se realizaron inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
chip experimentos como se describe anteriormente [19], con modificaciones menores. Se utilizaron células HCT116 para la reticulación con 1% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min. Las células se rasparon y se recogieron por centrifugación. Las células se lisaron en tampón de lisis (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% desoxicolato, y 1,0 mM de cóctel inhibidor de la proteasa) y se sonicó durante 20 segundos 3 veces. se añadió IgG de ratón normal, anti-β-catenina o anticuerpo anti-HDAC1 y se incubaron durante 6 horas a 4 ° C. Immnunocomplexes se extrajeron 3 veces con 1% SDS, 0,1 M NaHCO3, y la reticulación se invirtió mediante incubación a 65 ° C durante la noche. La fracción de entrada de la cromatina guardado también se procesó de la misma manera. Las muestras fueron entonces digeridos con DNasa y RNasa libre de proteinasa K a 50 ° C durante 4 h, y se extrajeron con fenol /cloroformo /alcohol isoamílico. Las muestras de ADN fueron purificados con columnas Qiagen limpieza. La región PLD2 o promotor NOS2 se analizó por Q-RT-PCR usando cebadores específicos (Tabla S4).
migración celular y la invasión ensayos
Se añadieron las células a cámaras de membrana Transwell (tamaño de poro, 12,0 micras; Corning). El número de células que migró a través de la membrana a la cámara inferior se contó después de 24 horas. Para los experimentos de siRNA, se sembraron las células 24 horas después de la transfección con siRNAs, y ensayos de migración se realizaron durante otras 24 horas. se añadió a cámaras de membrana Transwell y se incubaron durante 5 horas;;: Para los ensayos de invasión, Matrigel (BD 5 1) entonces se sembraron las células. Alcance de la migración y la invasión se expresa como un número medio de células por campo microscópico.
independiente de anclaje ensayo de crecimiento
crecimiento independiente del anclaje se midió utilizando el CytoSelect ™ de 96 pocillos
En Vitro tumor
la sensibilidad del ensayo (célula Biolabs, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. el crecimiento independiente del anclaje se examinó en agar blando; se añadieron 50 l de matriz de agar base hasta la parte inferior de cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Una vez que el agar era sólido, 75 l de suspensión de células de la matriz de agar /blanda que contiene 3 × 10
3 células se estratificó sobre la parte superior, seguido de 50 l de 2 x medio completo con Wnt3a y /o inhibidores. Después de 10 días de incubación, la matriz de agar se solubilizó, y se añadió 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil bromuro de tetrazolio a cada pocillo. La absorbancia producido por la formación de producto formazan insoluble por las células viables se registró a 570 nm.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces, con resultados similares. Los datos fueron analizados por
t
test de Student, y
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
señalización de Wnt promueve la expresión de PLD. isoenzimas
para examinar la cuestión de si o no la señalización de Wnt aumenta la expresión PLD, células de cáncer colorrectal HCT116 se expusieron a Wnt3a o Wnt3a miméticos (Figura 1). Como se determina por inmunoprecipitación y Western blot, la expresión de ambos PLD1 y PLD2 se ha mejorado de una manera dependiente del tiempo tras la exposición a purificada Wnt3a recombinante (150 ng /ml) (Figura 1A, panel superior). El anticuerpo anti-PLD fue generado contra el péptido C-terminal de PLD1 en la que 7 aminoácidos entre los 12 aminoácidos fueron los mismos con la de PLD2, y reconoce tanto PLD1 y PLD2 [18]. Se demostró que las células HCT116 tienen mutaciones en β-catenina en Ser-45 y que este Ser-45 alelo mutante no era suficiente para apoyar la tumorigénesis de las células HCT116 [20] - [22]. Por lo tanto, se sugiere que la vía de β-catenina en las células HCT116 no está completamente activado por la mutación, y por lo tanto puede ser estimulada por medio de mensajeros extracelulares adicionales, tales como la señalización de Wnt, resultando en aún más la transformación oncogénica. Luego investigó la cuestión de si o no la expresión PLD señalización inducida por Wnt podría ser regulada a nivel transcripcional. Wnt3a mejorado los niveles de mRNA de PLD1 y PLD2 de una manera dependiente del tiempo (Figura S1). Para excluir que el incremento de Wnt dependiente del PLD ARNm es sólo causado por los cambios en la estabilidad del mRNA, se realizó un ensayo de descomposición de ARNm utilizando actinomicina D, lo que impide la transcripción. La expresión de PLD1 y PLD2 se incrementó con el tiempo de una manera comparable entre Wnt-células tratadas y de control tal como se analizó por Q-RT-PCR (Figura S2). El pretratamiento con actinomicina D suprimió significativamente tanto los niveles basales e inducidos-Wnt3a PLD de ARNm (Figura S2). Por lo tanto, el aumento de Wnt-dependiente de PLD mRNA es de hecho debido a la transcripción elevada. Con el fin de fortalecer aún más nuestros resultados, se determinó el efecto del bloqueo de GSK-3β en la expresión PLD. LiCl y BIO se establecen agonistas que imitan la vía de señalización de Wnt, conduce a la activación y estabilización de β-catenina [23], [24]. Como se analizó por inmunoprecipitación y Western blot, LiCl (20 mM), BIO (1 M), y Wnt3a (150 ng /ml) aumentó significativamente el nivel de expresión de las isoenzimas de PLD (Figura 1B). miméticos de Wnt también aumentó el nivel de proteína de β-catenina, así como la expresión de c-Myc y NOS2, los genes diana de la señalización de Wnt. Como se analiza por Q-RT-PCR, la señalización Wnt marcadamente elevados niveles de expresión de ARNm de PLD (Figura 1C). Además, Wnt y sus miméticos de mejora de forma significativa la actividad del promotor de ambos PLD1 y PLD2 (Figura 1D); Wnt3a acompañó a un aumento significativo en la expresión génica de un TCF /LEF luciferasa específico reportero plásmido (TOPflash) utilizado como control. Por otra parte, se encontró que Wnt3a aumenta los niveles de expresión de PLD isoenzimas en diversas células cancerosas, incluyendo células de cáncer colorrectal (HCA-7, RKO, Colo-741) y las células de cáncer de mama (Hs578T) (figura S3). Para observar la inducción de isoenzimas PLD en respuesta a la señalización de Wnt, elegimos las células de cáncer en el que el estado de la vía de Wnt es normal. Se sabe que estas células de cáncer de expresar APC de tipo salvaje y β-catenina [25] - [29]. Por lo tanto, se sugiere que la expresión de PLD de señalización inducida por Wnt podría ser un fenómeno general. La regulación positiva de la expresión de PLDs por Wnt3a y Wnt miméticos implicado fuertemente un papel central para la inhibición de GSK3 y la vía canónica de señalización Wnt en efectos mediados por Wnt. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inducción del enzima PLD como una nueva diana de señalización Wnt está regulada tanto a nivel transcripcional y post-transcripcional.
células HCT116 (A) fueron tratadas con Wnt3a purificado recombinante (150 ng /ml) durante los tiempos indicados, y los lisados se inmunoprecipitaron y a inmunotransferencia con el anticuerpo para PLD. β-catenina se analizó mediante transferencia Western usando lisados nucleares (panel superior). Los histogramas muestran los niveles de proteína relativos de PLD1 y PLD2, que se normalizan a los valores de α-tubulina correspondientes (panel inferior). células HCT116 (B-C) se trataron con Wnt3a (150 ng /ml), LiCl (20 mM), o BIO (1 M) durante 24 h. (B) el nivel de proteína del PLD se analizó por inmunoprecipitación e inmunotransferencia. c-Myc y expresión NOS2 se analizó por transferencia de Western (panel superior). Los histogramas muestran los niveles de proteína relativos de PLD1 y PLD2, que se normalizan a los valores de α-tubulina correspondientes (panel inferior). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. los niveles de (C) de mRNA de los genes indicados se analizaron por Q-RT-PCR. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
vehículo. (D) Los plásmidos informadores promotoras indicadas fueron transfectadas y tratadas con Wnt3a, LiCl, o BIO durante 12 h; A continuación se determinó la actividad de luciferasa. *
P Hotel & lt; 0,01
frente
vehículo. Los datos representan la media ± S.D. de tres experimentos independientes.
LiCl induce la expresión de isoenzimas PLD
in vivo
Para fortalecer aún más nuestros resultados, se investigó el efecto del bloqueo de GSK3 en PLD la expresión
in vivo
. LiCl se inyectó en ratones, y la expresión de PLD fue investigado en varios tejidos, usando el anticuerpo anti-PLD que reconoce tanto PLD1 y PLD2. Hemos informado sobre la especificidad del anticuerpo al PLD [18], [30]. Como se analizó por inmunoprecipitación y de inmunotransferencia, LiCl aumenta los niveles de proteína de ambos PLD1 y PLD2 en colon, estómago, y los tejidos del hígado (Figura 2A). Como control positivo, el nivel de β-catenina y NOS2, así como la fosforilación de GSK3, se aumentó en los tejidos inyectados con LiCl. Un resultado complementaria con respecto a la expresión de PLDs después de la aplicación de LiCl también se obtuvo por inmunofluorescencia en tejidos de colon (Figura 2B). Los núcleos se contratiñeron por DAPI. Considerando β-catenina mostró un patrón de tinción membranosa en el colon de control inyectados con PBS, β-catenina se incrementó en LiCl en el citoplasma y núcleo de las células. nivel PLD se aumentó concomitantemente tanto en el citoplasma y núcleo de células en el colon con inyección de LiCl como β-catenina se incrementó (Figura 2B). En conjunto, estas observaciones indican que la expresión de ambos PLD1 y PLD2 se mejora en los tejidos de los ratones tratados con LiCl.
Ratones (A) se inyectaron por vía intravenosa con LiCl, como se describe en "Materiales y Métodos". Los lisados de diversos tejidos y se inmunoprecipitaron a inmunotransferencia con el anticuerpo para el reconocimiento de PLD tanto PLD1 y PLD2 (panel izquierdo). Los niveles de proteína se analizaron por inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados. Los histogramas muestran los niveles de proteína relativos de PLD1 y PLD2, que se normalizan a los valores de α-tubulina correspondientes (panel derecho). secciones (B) de parafina de tejidos de colon se sometieron a análisis de inmunofluorescencia usando anti-β-catenina (Alexa Fluor 488; verde) y (555 Alexa fluor; rojo) PLD anticuerpo. Los tejidos se controlaron usando Zeiss LSM 510 microscopio confocal. Se observaron campos Microscopía en × 650 aumentos. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
β-catenina y TCF-4 regulan positivamente la expresión de las isoenzimas PLD
Hemos examinado la cuestión de si la expresión de las isoenzimas PLD o no es, en efecto transcripcionalmente activado por β-catenina o TCF-4. Como se muestra en la Figura 3
A
, la expresión ectópica de TCF-4 y un mutante estable β-catenina (S37A β-catenina), que es insensible a la ubiquitinación de β-catenina, una mayor activación de la transcripción de ambos PLD1 y PLD2. TCF-4 y estable mutante β-catenina aumentaron significativamente la expresión génica de una luciferasa específico plásmido informador de TCF /LEF utilizado como control. Esta inducción se redujo significativamente mediante la adición de un dominante negativo (DN) TCF-4 vector de expresión (ΔN30 TCF-4) (Figura 3A). Además, el análisis por inmunoprecipitación y de inmunotransferencia mostró que la expresión ectópica de β-catenina o TCF-4 aumentó los niveles de proteína endógenos de PLD1 y PLD2 isoenzimas en células HCT116. genes TCF-regulada, incluyendo c-Myc y NOS2, también se incrementaron por la expresión de β-catenina o TCF-4 (Figura 3B). Además, la transfección de dnTCF-4 o el agotamiento de β-catenina usando shRNA disminuyeron los niveles de proteína de ambas isoenzimas PLD y genes diana de Wnt en las células HCT116 (Figura 3C). Estos resultados indican que la expresión de isoenzimas PLD está regulada positivamente por tanto β-catenina y TCF-4.
Células HCT116
(A) fueron co-transfectadas con los reporteros TOP /FOP pGL4 PLD-o y los vectores de expresión indicados. *
P Hotel & lt; 0,01
frente
simulacro; †
P Hotel & lt; 0,05
frente
S37A β-catenina /TCF-4. (B) Las células fueron transfectadas con el vector de expresión de TCF-4 o β-catenina, y los lisados se inmunoprecipitaron o inmunotransferencia con los anticuerpos indicados (panel superior). Los histogramas muestran los niveles de proteína relativos de PLD1 y PLD2, que se normalizan a los valores de α-tubulina correspondientes (panel inferior). (C) Las células se transfectaron con ΔN30 TCF-4 o shRNA para β-catenina. Los lisados se analizaron mediante inmunoprecipitación o transferencia de Western usando los anticuerpos indicados (panel superior). expresión de la proteína se cuantificó mediante análisis densitómetro. Los histogramas muestran los niveles de proteína relativos de PLD1 y PLD2, que se normalizan a los valores de α-tubulina correspondientes (panel inferior). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
β-catenina y TCF-4 se unen a las EBT del promotor PLD2 y potenciar la expresión PLD2
Un polimorfismo del gen PLD2 tiene poco ha asociado con la prevalencia de carcinoma colorrectal [31]. Por otra parte, los niveles de expresión de PLD2 detectados por PCR en tiempo real utilizando 97 tejidos de carcinoma colorrectal se correlacionaron significativamente con el tamaño del tumor y la supervivencia de los pacientes con carcinoma colorrectal; por lo tanto, se sugirió que el nivel de expresión PLD2 podría ser un indicador pronóstico en el carcinoma colorrectal [10]. Por lo tanto, hemos tratado de examinar las regiones que son responsables de /β-catenina expresión PLD2 Wnt /inducida por TCF-4.
Como se muestra en la Figura 4A, el promotor PLD2 -2180 /+ 491 se transactivated por TCF -4 (4,6 veces) o S37A β-catenina (2,3 veces) proteínas. Secuenciales deleciones 5 'del promotor PLD2 a las posiciones -1601, -1210 y -784 transactivación mediada por β-catenina no afectó a la TCF-4 o S37A del promotor PLD2 (TCF-4, 4,2 veces; ß-catenina activación de 2,2 veces de todos los mutantes); Sin embargo, la supresión de -380 regiones disminuyó significativamente TCF-4 o S37A promotor de la actividad PLD β-catenina-estimulados. Por lo tanto, se sugiere que el elemento de unión putativo TCF (TBE) en las posiciones -784 ~ -380 puede ser esencial para la regulación de genes por PLD2 TCF-4 y β-catenina.
(A) El análisis de deleción de pGL4- PLD2 en células HCT116. Se muestra una representación esquemática de constructos indicadores pGL4-PLD2. Las células se cotransfectaron con pGL4-PLD2 y los vectores de expresión indicados, seguido de la determinación de la actividad de luciferasa. (B) Representación esquemática de la región -2180-491 del promotor PLD2 humano. Los números encima de las líneas se refieren al sitio de inicio de la transcripción de la
PLD2
gen (1). Dos sitios de unión putativos para TCF-4 se indican en la secuencia (las flechas indican la dirección). las células (C) HCT 116 se transfectaron con el plásmido informador de luciferasa que contiene el tipo salvaje (wt) PLD2 promotor, una o doble TBE formas mutantes (mt) de promotor PLD2, y se trató con Wnt3a (150 ng /ml) o BIO (1 M). Se midieron las actividades de luciferasa. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
wtTBE /Wnt3a; †
P Hotel & lt; 0,01
frente
wtTBE /BIO. (D) Las células fueron co-transfectadas con los vectores de expresión indicados, junto con las formas mutantes WT o TBE del promotor PLD2. Se midieron las actividades de luciferasa. *
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frente
transfectadas con wtTBE /β-catenina; †
P Hotel & lt; 0,05
frente
wtTBE /TCF4; **
P Hotel & lt; 0,05
frente
transfectadas con wtTBE /β-catenina /TCF4. (E) Las flechas indican la posición de los cebadores usados en el experimento de chip. El chip de ensayo se realizó usando IgG preinmune, anti-β-catenina, o anticuerpo anti-HDAC1 y se analizó por Q-RT-PCR. Como control positivo, se realizó un análisis ChIP del promotor que contiene NOS2 TBE. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
β-catenina /vehículo; †
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frente
HDAC1 /vehículo. Los datos son representativos de cuatro experimentos independientes. (F) Diagrama esquemático para la comparación de TBE en PLD2 regiones promotoras de diversas especies. TCF-4 elementos de unión en 5 regiones flanqueantes del PLD2 humana sitio de inicio transcripcional (TSS) se compararon con los de los genomas de 4 diferentes especies. Un núcleo
motivo, CTTTG (A /T) (T /A) [o la secuencia complementaria (A /T) (T /A) CAAAG] de TCF secuencias de unión en el promotor PLD2 es altamente
conservada
través de las especies.
como se muestra en la Figura 4B, el análisis de secuencia de la secuencia flanqueante 5 'del gen PLD2 identificado dos TBE putativo (designado como TBE1 y TBE2). TBE1 (ATGAAAG) se encuentra -512 b aguas arriba, y contiene una coincidencia casi invertida con el consenso CTTTG (A /T) secuencia (A /T) para TCF-4 vinculante [32]; TBE2 (CTTTCAT) se encuentra -497 b acertaron aguas arriba y cerca de la secuencia de consenso (Tabla S2) [33].
Para examinar la importancia funcional del motivo TBE en la regulación de la transcripción de genes PLD2, la mutación dirigida al sitio de TBE sitios se generaron en el contexto de un promotor PLD2. La mutación en el sitio TBE1 o TBE2 disminuyó significativamente la actividad del promotor PLD2 Wnt3a inducida en las células HCT116 (Figura 4C). Las mutaciones tanto de los sitios TBE1 y TBE2 (TBE1 /2) suprimió drásticamente la actividad del promotor PLD2 Wnt3a estimulada. Por otra parte, inducida por β-catenina actividad promotora PLD2 TCF-4 y /o también cuando se abolió TBE1 y TBE2 fueron mutados (Figura 4D). Estos datos sugieren que el promotor PLD2 es un objetivo del complejo /β-catenina TCF a través de su TBE consenso.
Además, a continuación, realizó una inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayo en células HCT116 que confirmar
In vivo
unión de β-catenina /TCF-4 al promotor PLD2. DNA-β-catenina /TCF-4 complejos se inmunoprecipitaron con anticuerpos que se muestran en la Figura 4E, seguido de inversión de reticulación y Q-RT-PCR utilizando cebadores que flanquean tanto TBE1 y TBE2, que se encuentran en la posición proximal a la otra. Como se muestra en la Figura 4E, purificada Wnt3a recombinante unión mejorada de β-catenina /TCF-4 a ambos TBE del promotor PLD2. Estos resultados son comparables con los del ensayo de promotor usando mutagénesis. objetivos de la señalización de Wnt ß-catenina a la cromatina para la eliminación de la HDAC1 corepressor (histona desacetilasa 1) [34]. Como era de esperar, Wnt3a suprimió significativamente la unión de β-catenina a dos TBE del promotor PLD2 después de que el chip de ensayo, usando el anticuerpo anti-HDAC1. Por otra parte, se encontró que TCF sitios en el promotor PLD2 unión se conservan en todas las especies (Figura 4F). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el gen PLD2 es un objetivo transcripcional directa de β-catenina /TCF señalización in vivo.
se requieren isoenzimas PLD para la formación de la β-catenina /TCF-4 complejo y promoción de β-catenina /TCF transcripcional actividad
Hemos investigado la cuestión de si o no la regulación positiva PLDs la señalización inducida por Wnt podrían modular la actividad transcripcional TCF-catenina que dependen de β a través de un bucle de retroalimentación positiva. La expresión ectópica de un mutante activa constitutiva de β-catenina aumento de la actividad transcripcional TCF en células de cáncer de colon HCT116 (Figura 5A). Los inhibidores selectivos de PLD se han desarrollado recientemente [35], [36].