Extracto
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico que exhibe la más alta morbilidad y la mejora de los tratamientos sigue siendo necesaria. Estudios anteriores han demostrado que (ERβ) los niveles de beta del receptor de estrógeno se redujeron a lo largo con la carcinogénesis de ovario. A continuación, presentamos evidencia de que la reintroducción de ERβ en las células de cáncer de ovario BG-1 epiteliales, que expresan ER, cables
in vitro
a una disminución de la proliferación de células basales y el estradiol-promovido. ERβ redujo la frecuencia de células en fase S y aumentó la de las células en fase G2 /M. A nivel molecular, se encontró que ERβ downregulated retinoblastoma total (Rb), Rb fosforilado y el contenido celular de fosfo-AKT, así como las ciclinas D1 y A2. Además, ERβ tuvo un efecto directo sobre ER, inhibiendo fuertemente su expresión y actividad, lo que podría explicar parte de la acción antiproliferativa de ERβ. Mediante el desarrollo de un modelo preclínico novela de cáncer de ovario basado en un xenoinjerto ortotópico luminiscente en ratones desnudos atímicos, que reveló además que la expresión de ERβ reduce el crecimiento del tumor y la presencia de células tumorales en los sitios de metástasis, por lo tanto, lo que mejora la supervivencia de los ratones. En conjunto, estos resultados revelan un papel potencial supresor de tumores de ovario ERβ en la carcinogénesis, que podría ser de relevancia clínica potencial para la selección del tratamiento más adecuado para los pacientes
Visto:. Bossard C, M Busson, Vindrieux D, F Gaudin, Machelon V, Brigitte M, et al. (2012) papel potencial de los Receptores de Estrógenos Beta como un supresor de tumores de cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 7 (9): e44787. doi: 10.1371 /journal.pone.0044787
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de noviembre de 2011; Aceptado: August 13, 2012; Publicado: 6 Septiembre 2012
Copyright: © Bossard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de ARC (Asociación para la Investigación del cáncer contre le, la subvención No. 3582) (http://www.arc-cancer.net), La Ligue Nationale contre le cáncer (http: //www.ligue-cancer .red). Muriel Busson fue apoyada por FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) (http://www.frm.org). DV era un recipiente de la Ligue Nationale contre le Cancer. CB fue apoyado por una beca HFSP (http://www.hfsp.org/). El laboratorio KB es apoyado por la Agencia Nacional de Investigación (ANR, conceder el número 2010 1104 01 jcjc) (http://www.agence-nationale-recherche.fr/), la Université Paris-Sud, el Institut National de la Salud y de la Investigación Médica (INSERM) y la Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité Val d'Oise), y es miembro del Laboratorio de Excelencia Lermit (Laboratorio de Excelencia en Investigación sobre Medicamentos y Terapéutica innovador) apoyado por una beca de la ANR (Investissements d'Avenir). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la capa de células epiteliales único que rodea ovarios se cree actualmente que una de las fuentes de lesiones preneoplásicas principales lugar a epitelial tumores de ovario, que representan la gran mayoría de tipos de cáncer [1] de ovario. cáncer de ovario epitelial (EOC) es el séptimo cáncer más común. Sin embargo, sigue siendo el cuarto más mortal, ya que es difícil de diagnosticar en las primeras etapas y, por lo tanto, para el tratamiento de [2]. Ya sea clasificada en categorías morfológicas (es decir, seroso, mucinoso, endometrioide y células claras) sobre la base de criterios histológicos y la semejanza con los componentes epiteliales del tracto reproductivo normal, o más recientemente, clasificado como tumores de bajo o alto grado [2], EOC es una enfermedad compleja para la que no se conoce bien la etiología. Se necesitan con urgencia por lo tanto marcadores novedosos y objetivos para terapias.
El ovario es el órgano principal de la producción de estrógenos, que principalmente impacto en el crecimiento, diferenciación y función de los tejidos reproductivos [3]. A través de su acción mitogénica, los estrógenos juegan un papel en la carcinogénesis de ovario. Varios estudios han puesto de manifiesto un aumento del riesgo de cáncer de ovario en pacientes que reciben terapia de reemplazo de estrógenos a largo plazo [4], [5], [6], [7], mientras que los pacientes tratados con estrógenos y progestinas orales anticoncepción combinando mostraron un menor riesgo de el desarrollo de un cáncer de ovario [8], [9]. acción de los estrógenos está mediada por dos receptores, ER y ERβ, dos factores de transcripción de una gran familia de receptores nucleares [10], [11]. Alrededor del 40 al 60% de los cánceres de ovario expresan ER [12], pero es intrigante notar que sólo una pequeña proporción de ellos se beneficiará de la terapia anti-estrógenos [13]. El papel de ERβ en la biología de ovario sigue siendo poco conocida, pero parece ser diferente de la de ER [14].
ERβ
ronda animales (βERKO) son subfértiles, produciendo un menor número de camadas y cachorros a la inducción de la superovulación [15], [16]. Los ovarios de animales βERKO contienen un menor número de grandes folículos antrales y del cuerpo lúteo en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje, que es concomitante con menores niveles de estradiol producidos [17] y una expresión reducida de genes clave implicados en la función del ovario como la aromatasa (
CYP19A1
), receptor de LH (
LHCGR
), y la prostaglandina sintasa 2 (
Ptgs2
) [18].
Varios estudios han desentrañado un posible papel de ERβ en EOC. En particular, los niveles de ERβ fueron menores en los tumores de ovario en comparación con los tejidos normales [19], [20], [21], [22]. Por otra parte, la pérdida de expresión de ERβ podría correlacionar con una supervivencia global más corta de los pacientes con cáncer de ovario [23]. ERβ niveles también están asociados con el estado de los ganglios linfáticos metastásicos [24]. Un polimorfismo (rs127572) del gen
ERβ
también se ha identificado recientemente y demostrado que se asocia con un mayor riesgo de desarrollar un cáncer de ovario [25]. Sin embargo, todavía no se sabe si este polimorfismo afecta a la expresión de ERβ. La localización intracelular de ERβ en las células tumorales parece ser importante. De hecho, un estudio reciente ha demostrado que ERβ se localizó en el citoplasma de las células tumorales, mientras que era principalmente nuclear en las células epiteliales normales [26]. Además, la expresión citoplásmica de ERβ fue correlacionada con un mal resultado para los pacientes con cáncer de ovario seroso avanzada [14]. Estos hallazgos, junto con las correlaciones clínicas antes mencionadas entre ERβ y la supervivencia del paciente, nos llevan a la hipótesis de que ERβ es un factor crítico en la progresión del tumor de ovario y para delinear la contribución exacta de este receptor en las vías moleculares que subyacen a la carcinogénesis EOC.
Con este fin, hemos utilizado células BG-1 como modelo celular y se aprovechó de un modelo ortotópico de xenoinjerto en ratones que hemos desarrollado. BG-1 línea celular es una línea celular humana derivada de EOC un sólido tejido tumoral primario de un paciente con estadio III, pobremente diferenciado adenocarcinoma de ovario [27]. Estas células expresan ER y son sensibles a los estrógenos en términos de proliferación [21], [28]. Los modelos experimentales de carcinogénesis de ovario son esenciales para comprender los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la enfermedad, sino también para evaluar la eficacia de nuevos fármacos terapéuticos [29]. Varios modelos han sido desarrollados, incluyendo diferentes xenoinjerto y modelos transgénicos, ninguno de ellos está totalmente satisfactoria. Los modelos de xenoinjerto que se utilizan actualmente son o intraperitoneal, subcutánea o ortotópicamente intrabursal en el ovario. Sólo unos pocos informes describen xenoinjerto ortotópico. Sin embargo, la implantación de células ortotópico puede ser percibido como más fisiológica, ya que las células cancerosas se inoculan directamente en el entorno de ovario y pueden dar lugar a metástasis. Por lo tanto, para investigar el papel de ERβ en EOC carcinogénesis, se optó por aprovechar las ventajas de un modelo de ratón con xenoinjerto ortotópico basado en el uso de la luciferasa (Luc) que expresan las células cancerosas de ovario epitelial BG-1 humano.
Mostramos aquí que la reintroducción de ERβ en las células BG-1 usando un cables de adenovirus
in vitro
a una inhibición de tanto basal como la proliferación celular inducida por estradiol. ERβ ejerce su acción anti-proliferativa a través de una reducción de la frecuencia de células en fase S, un aumento de células en fase G2, junto con una expresión alterada de los reguladores del ciclo celular. A nivel molecular, ERβ fue capaz de reprimir la expresión, la actividad y la señalización de ER, y por lo tanto para bloquear su acción proliferativa. Por otra parte, ERβ fue capaz de reducir fuertemente el desarrollo de xenoinjerto de ovario ortotópico, así como la presencia de células tumorales los sitios de metástasis, lo que lleva a un aumento de la supervivencia de los ratones. En conjunto, estos resultados apoyan el papel de ERβ como supresor de tumores en EOC carcinogénesis.
Resultados
Los informes anteriores han demostrado que ERβ se expresa débilmente en los tejidos de EOC y derivar líneas celulares en comparación con el tejido normal [11]. Nos aprovechamos de la línea celular humana EOC BG-1, que expresa niveles endógenos de ER y es sensible a los estrógenos [27]. En este sentido, en primer lugar confirme que las células BG-1 muestran bajos niveles de estado estacionario de productos ERβ, es decir, ARNm y proteínas (fig. 1A, B). El siguiente paso para evaluar el papel de ERβ en la carcinogénesis ovárica era restaurar su expresión en células de cáncer de ovario. Por lo tanto, BG-1 células fueron infectadas con una cadena principal (Ad5) o humano
ERβ
(Adβ) que codifica adenovirus [30], [31].
ERβ
sobreexpresión de hecho se obtuvo en las células infectadas por el Adβ como validado por PCR en tiempo real y análisis de Western blot (Fig. 1A, B). Curiosamente, los niveles ERβ eran fuertemente las reguladas por el estradiol (E2), tanto a nivel de ARN y proteínas. Por otra parte, en ausencia de ERβ, los niveles de ER fueron también regulados hacia abajo por E2, aunque en menor medida. Cuando ERβ se introdujo en las células, el nivel de expresión basal de ER en ausencia de E2 se redujo y por medio. La presencia de ERβ disminuida fuertemente los niveles de ER en presencia de E2 (disminución de más de 15 veces en 3 h), lo que sugiere que ERβ mejora la degradación de ER. Esto es probablemente debido a la degradación del proteasoma dependiente de las proteínas ER y ERβ [32]. a continuación, se investigaron los efectos de la sobreexpresión ERβ en la capacidad de respuesta de estrógeno. Se analizó la capacidad de los ERβ transactivate un reportero de la luciferasa sintética sensibles a los estrógenos en las células BG-1. Endógeno ER fue capaz de activar el indicador en presencia de E2 (Fig. 1C). ERβ reprimida fuertemente la actividad de ER en respuesta a E2, lo que sugiere que en presencia de ER, ERβ se comporta más bien como un represor de un activador de la señalización de estrógenos. Para asegurar la funcionalidad del receptor producida, también registramos la actividad de ERβ en la línea celular EOC PEO14 [33] que se informa para expresar bajos niveles de ER (Fig. 1E) y por lo tanto no responde a los estrógenos [34] . Ambos ER y ERβ fueron capaces de estimular un reportero sensible al estrógeno después de la exposición E2, aunque ERβ fue un poco menos activo que ER (Fig. 1D). Por lo tanto, en ausencia de ER, ERβ conserva la capacidad de transactivar señalización de estrógenos vías. Cuando ER y ERβ se coexpresan en PEO-14 células, la actividad del indicador en presencia de E2 fue similar a la de ER solo. Esto sugiere que en la línea celular de PEO-14 ER-negativo, ERβ no puede afectar a la actividad de ER. experimentos de Western blot en PEO-14 células muestran que cuando ER y ERβ se expresaron por separado, sus niveles eran fuertemente disminuyeron en presencia de E2 (Fig. 1E). Cuando se coexpresan ER y ERβ, la degradación de ER en presencia de E2 se incrementó ligeramente pero no en la proporción observada en las células BG-1. Para ERβ, la co-expresión de ER mejoró ligeramente la degradación de ERβ. En general, estos datos sugieren que los niveles de ER no están regulados de la misma manera en BG-1 y PEO-14 células, lo que podría explicar por qué la actividad ER no se reduce drásticamente por la presencia de ERβ en PEO-14 en comparación con BG-1 las células.
BG-1 células fueron infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus y tratadas durante 24 horas con etanol vehículo de control (control) o E2 10
-8M (E2). La expresión del gen de referencia y ERβ RS9 se midió por PCR en tiempo real. Los resultados representan la media ± SD de expresión ERβ normalizado por RS9 de 3 experimentos independientes. Las mediciones de los grupos Adβ y Adβ + E2 fueron comparadas por
t
de Student no pareada. ** P & lt; 0,001. B. Las proteínas se extrajeron a partir de células infectadas en las mismas condiciones que en A y tratados de 0, 3, 6 o 24 horas con E2 10
-8M (E2). Los niveles de ER y ERβ se analizaron por Western blot. Actina se utilizó como control de carga. La banda superior de ERβ blot marcado con una estrella corresponde a la tinción inespecífica. C. La actividad transcripcional de ERβ. BG-1 células fueron infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus y transfectadas con el reportero ERE2-TK-Luc junto con el reportero de β-galactosidasa. Las células se trataron con etanol como vehículo (control) o E2 (10-8 M) durante 24 h. Los resultados muestran actividades relativas Luc (% de los valores de las células infectadas con Ad5 sin E2) ± SD después de la normalización con la actividad β-gal (3 experimentos independientes). Las mediciones de los grupos Ad5 + E2 y Adβ + E2 fueron comparadas por
t
de Student no pareada. * P & lt; 0,05. células D. PEO14 se infectaron con Ad5, Adα, Adβ o la combinación de Adα y Adβ adenovirus y transfectadas con el reportero ERE2-TK-LUC junto con el reportero de β-galactosidasa. Las células se trataron con vehículo de control (Control) o E2 (10-8 M) durante 24 h. Los resultados muestran las actividades relativas de luciferasa (% de los valores de las células infectadas sin Ad5 E2) ± SD después de la normalización con la actividad β-gal (3 experimentos independientes). Las mediciones de Adα, Adβ y Adα + ß grupos fueron comparados por
t
de Student no pareada. *** P & lt; 0,001. NS: no significativo. E. Las proteínas de las células infectadas PEO14 en las mismas condiciones que en el D y tratados con etanol vehículo (control) o E2 10
-8M (E2) para 3, 6 o 24 horas se analizaron por transferencia de Western con anticuerpos contra ER y ERβ . Actina se utilizó como control de carga. La banda superior marcado con una estrella en el panel de la derecha corresponde a la tinción inespecífica.
A continuación estudiamos los efectos de
ERβ
expresión en la proliferación de células cancerosas. Se hicieron crecer las células BG-1 infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus
in vitro
en ausencia o en presencia de E2. Como era de esperar, E2 estimuló la proliferación de control de BG-1 en las células (Fig. 2A). Curiosamente, ERβ reprimida por 50% tanto en la basal y la proliferación dependiente de E2 de las células BG-1. También se observó la acción anti-proliferativa de ERβ en ERα- y células PEO14 ERβ-negativos. Sin embargo, esta inhibición no fue afectada por E2 (Figura S2). Mientras que el
in vitro
efectos de ERβ se han observado hasta el momento, se sabe muy poco de su
in vivo
acción en modelos de cáncer de ovario. Como una primera aproximación para evaluar este punto, se utilizó un modelo de la inyección subcutánea. Para habilitar un sensible, dinámico y principios de seguimiento del crecimiento del tumor, que transfectadas establemente células BG-1 con un reportero Luc constitutiva. Los ratones desnudos atímicos ovariectomizados se les implantó un pelet de colesterol o E2 y inyectados con células BG-1 infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus. células BG-1 forman tumores sólo en presencia de E2 (Fig. 2B).
ERβ
expresión redujo significativamente en un 70% el crecimiento promovido-E2 de las células BG-1, lo que apoya un posible papel antiproliferativo para ERβ en EOC.
El crecimiento de las células BG-1 , expresando o no ERβ, se controló
in vitro
usando un contador de células. células BG-1 se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron en presencia de vehículo o E2 (10
-8M). La proliferación se expresó como% de control de las células cultivadas en el día 0. Los datos representan la media ± SD de los triplicados. Las mediciones de los grupos Ad5 + E2 y Adβ + E2 fueron comparadas por
t
de Student no pareada. ** P & lt; 0,001. B. ERβ inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de ratón subcutánea bioluminiscente. BG-1 células que expresan de forma estable Luc e infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus fueron inyectados por vía subcutánea en ratones desnudos hembra ovariectomizadas. La actividad de luciferasa se controló durante 25 días. Los resultados se expresan en fotones /s (Ph /s) y representan la media ± SD de 8 animales. Las mediciones de los grupos Ad5 + E2 y Adβ + E2 fueron comparadas por
t
de Student no pareada. * P & lt;.
0,05
A continuación, explora los mecanismos responsables de la acción anti-tumoral de ERβ. distribución del ciclo celular se comparó por citometría de flujo en el control y ERβ células que expresan BG-1 (Fig. 3A). No se detectó ningún pico SubG0, lo que sugiere que no se produjo la apoptosis.
ERβ
expresión no modificó la proporción de células BG-1 en la fase G0-G1, pero redujo fuertemente la de las células en la fase S. También se encontró que
ER β expresión
provocó un aumento del número de células en fase G2-M del ciclo celular. La expresión de los marcadores del ciclo celular se controló por análisis de Western blot (Fig. 3B) siguiente. Se ha informado que varios reguladores del ciclo celular, tales como ciclinas A y D1, AKT y Rb ser regulados por estrógenos [35]. Hemos observado que la fosforilación de AKT se incrementó tras el tratamiento E2 en infectadas con Ad5 células BG-1 (Fig. 3B).
ERβ
expresión dio lugar a una disminución en el contenido de fosfo-AKT en las células con vehículo y con pezones-E2 y esto ocurrió a los 3, 6 y 24 h. ERβ causó cambios similares en ciclina D1, Rb total y la expresión de Rb fosforilada. De hecho, los niveles de ciclina D1, Rb total y fosforilados Rb fueron regulados hasta después del tratamiento E2 en las células infectadas Ad5 y esta inducción se redujo en ERβ. Ciclina A2 representada a 24h inducción tarde después del tratamiento E2 y esto se redujo por la presencia de ERβ.
se recogieron las células BG-1 24 h después de la infección con Ad5 o Adβ adenovirus y se analizaron para la distribución del ciclo celular. Los resultados representan la media ± SEM de 3 experimentos. grupos Ad5 y Adβ fueron comparadas por
t
de Student no pareada. ** P & lt; 0,001. B. células BG-1 fueron infectadas con el virus Ad5 o Adβ. Después de la infección, las células fueron tratadas durante 3, 6 o 24 h con vehículo (etanol, C) o 10
-8M E2. 30 g de extractos de proteína se utilizaron para la transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. Salvo que se especifique, la proporción de proteínas diana sobre β-actina se indica debajo de los geles. Representante de 2 experimentos.
Para profundizar en el
in vivo
papel de ERβ en la carcinogénesis de ovario, hemos creado un modelo más fisiológico de la implantación ortotópico de células tumorales en el ovario. Ad5 o células BG-1-Luc infectados por Adβ se inyectaron en el crecimiento del tumor de ovario y de izquierda se controló mediante bioluminiscencia. Como se muestra en la Fig. 4A,
ERβ
expresión significativamente impedido el crecimiento del tumor. Cuando la eutanasia en el día 28 después de la inyección, los ratones de control muestran un claro aumento de volumen peritoneal y del volumen del tumor en el ovario izquierdo (Fig. 4B). En agudo contraste, el volumen de ambos peritoneo y ovario apareció muy reducida en ratones inyectados con células que expresan ERβ-BG-1. A continuación se determinó si el proceso metastásico se vio afectada por
ERβ
expresión. Para lograr esto, se recogieron los pulmones, el hígado y ovario derecho contralateral. La extensión de las células tumorales presentes en estos órganos se estimó midiendo la actividad Luc en nuestro modelo ortotópico. se detectó actividad de la luciferasa en el pulmón, hígado y ovario contralateral de los ratones inyectados con las células infectadas con Ad5 BG-1, (Fig. 5A). Curiosamente,
ERβ
expresión reducida fuertemente la presencia de células tumorales y la metástasis potencialmente a todos estos órganos, lo que sugiere que ERβ ejerce una doble función en el crecimiento y diseminación tumoral. Esto fue confirmado por
in vitro
cicatrización de la herida experimentos que muestran que
ERβ
expresión disminuye la motilidad de las células BG-1 (datos no mostrados). Desde ERβ impactado tanto en el crecimiento tumoral y la diseminación de células, nos preguntamos si esto podría permitir mejorar la supervivencia de ratones. Los ratones fueron seguidos durante 80 días y diariamente comprobar cualquier signo de morbilidad.
ERβ
expresión retrasó significativamente la muerte como dos meses después de la inyección con células BG-1 infectadas con Adβ, el 50% de los ratones todavía sobrevivieron (Fig. 5B). Esto está en fuerte contraste con la muerte del 100% de los ratones de control, que se produce en menos de dos meses.
Se inyectaron células BG-1-Luc infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus en el ovario izquierdo de ratones desnudos. actividad Luc se controló durante 35 días como se describe en la Fig. 1C. Los resultados se expresan en fotones /s (Ph /s) y representan un experimento representativo correspondiente a la SD media ± de al menos 5 animales por grupo. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para la comparación. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01. Se muestra una imagen representativa de 35 días. Se muestran las imágenes B. representativos de la totalidad de animales y tracto genital de los animales sacrificados en el día 35.
Los ratones desnudos inyectados con células BG-1-Luc en las mismas condiciones que en la Fig. 4. fueron sacrificados 28 días después de la inyección. Pulmón, hígado y ovario contralateral derecha se tomaron y la actividad Luc se ensayó como se ha mencionado anteriormente. Los resultados se expresan en forma de fotones /s /mg de proteínas y representan la media de 5 animales ± SEM. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para la comparación. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01. B. curva de supervivencia de Kaplan-Meier. 10 ratones fueron ortotópicamente xenoinjertado con células BG-1 que expresan establemente Luc, infectadas con Ad5 o Adβ adenovirus, un seguimiento diario del desarrollo de distrés respiratorio, parálisis de las extremidades y pérdida de peso, y sacrificados inmediatamente si se indica. valor de p es el obtenido en las pruebas de log-rank.
Discusión
Presentamos aquí que la introducción de ERβ en las células de cáncer de ovario que muestra los niveles endógenos de ER conduce a una inhibición fuerte de
in vivo
el crecimiento y la difusión celular, mediada a través del control de la expresión de ER y la señalización.
in vitro
experimentos de proliferación muestran una clara inhibición de la proliferación dependiente de E2 por ERβ en la línea celular de cáncer de ovario ER-positivo BG-1. Esta es la primera demostración de una acción anti-proliferativa de ERβ en una línea celular de cáncer de ovario ER-positivo. Por otra parte, ERβ también podría inhibir el crecimiento de la línea celular de cáncer de ovario ER-negativo PEO-14. Estos resultados están de acuerdo con nuestros resultados previos obtenidos con líneas celulares ER-negativos de mama [31] y de próstata [30] las células cancerosas y con otro estudio realizado en la línea celular derivada de EOC SKOV3 ER-negativos [36]. En las células carentes de receptores de estrógenos, es probable que la restauración de ER no puede permitir una estimulación de la proliferación tras el tratamiento E2, ya que desencadena un programa diferente de la regulación transcripcional, en comparación con las células que expresan naturalmente ER, según lo demostrado previamente en células de cáncer de mama [37 ]. De hecho, se observó que los niveles endógenos ER en las células BG-1 se reducen fuertemente por la presencia de ERβ, mientras que ERβ menos afectados los niveles de ER en PEO-14 células. Por otra parte, ERβ podría inhibir la actividad completamente ER en las células BG-1 pero no en PEO-14 células. Esto podría ser debido al hecho de que en las células BG-1, endógeno ER está bajo el control de su propio promotor, mientras que en PEO-14 células, ER exógeno es controlado por un promotor viral. Por otra parte, no se puede excluir que los cofactores necesarios para la actividad ER y ERβ en los dos tipos de células son diferentes, lo que explica su actividad diferencial en las células BG-1 y PEO-14.
La novedad de nuestro estudio se han extendido a estos datos para dos
in vivo y modelos. Si evidencias clínicas basadas en niveles ERβ en el tejido normal y el cáncer sugieren que este receptor podría actuar como un supresor tumoral potencial, hasta ahora, no hay pruebas preclínicas se ha traído para confirmar esta hipótesis. En primer lugar, se utilizó un modelo subcutánea clásica, para responder a esta pregunta y, más precisamente, para determinar si se requiere o no el estrógeno. BG-1
in vivo
crecimiento fue claramente dependiente de la presencia de estradiol y ERβ podría contrarrestar el crecimiento del tumor. También usamos implantación ortotópica de células bioluminiscentes en el ovario. De acuerdo con
in vitro
experimentos, se observó una fuerte reducción del crecimiento del tumor cuando las células BG-1 expresan ERβ.
análisis del ciclo celular demostró que ERβ inhibe la proliferación celular, por la disminución de la proporción de células en fase S y el aumento de la proporción de células en fase G2-M. Esta situación es similar a la reportada en células de cáncer de mama [38]. A nivel molecular, ERβ podría disminuir la fosforilación de Akt y Rb. Además, ERβ también redujo la expresión de la ciclina D1 y ciclina A. Ciclina D1 interactúa con quinasa dependiente de ciclina-4 y -6, que conduce a la fosforilación de Rb y la disociación de Rb /E2F complejo, que hace que la progresión a través de la G1 [35]. Ciclina A interactúa con quinasa dependiente de ciclina-2 para promover la transición de la S a la fase G2 [39]. Por otra parte, la fosforilación de AKT favorece transición G1 /S mediante el bloqueo de la actividad transcripcional de los factores Foxo, que regulan la expresión de ciclina D1 y p21 [40]. Sobre la base de estos resultados, proponemos que ERβ conduce a una disminución en la fosforilación de AKT, que a su vez se traduce en una disminución de expresión de ciclina D1 y la fosforilación de Rb.
Para explicar cómo ERβ puede afectar la proliferación celular, tenemos investigó si se podía modificar directamente la expresión de ER y la señalización en las células BG-1. En efecto, es interesante notar que ERβ tiene también efectos profundos de los niveles de ER ya que disminuye por la expresión de aproximadamente 15 veces ER en 3 h. Aunque los mecanismos moleculares exactos que representan el efecto negativo de ERβ en ER en las células BG-1 aún no se ha dilucidado, el alcance y la velocidad de degradación de ER es ciertamente crítico para su actividad y estos parámetros cambian si ERβ está presente o no. De hecho, en las células BG-1 parentales, que expresan sólo ER, el receptor está también sometida a la degradación dependiente de E2. Esto es probablemente debido a la degradación proteasomal del receptor como se muestra en una serie de tipos de células por estudios previos [41], [42]. Paradójicamente, también se requiere la degradación proteasomal E2 dependiente de ER para su actividad completa a través de la regulación de las interacciones de los receptores con sus coactivators [42] y el ciclo de ER en el promotor de sus genes diana [43]. La situación parece diferente cuando ERβ se coexpresan con ER en las células BG-1. En efecto, nos informan de que ERβ podría reducir más rápida y fuertemente la expresión de ER en las células BG-1 en presencia de E2, en comparación con las células en las que sólo ER está presente. Esto está de acuerdo con lo que se observa en la línea celular de cáncer de mama ER-positivo T47-D transfectadas con ERβ [44]. Esto sugiere que ERβ podría provocar una degradación proteasomal rápida de ER en presencia de E2. Si suponemos que ER y forman heterodímeros ERβ como se describe anteriormente [45], [46], ERβ puede aumentar la degradación de ER presente en el complejo, alterando su conformación y evitando que sea activo. En consecuencia, ER sería menos eficiente para activar sus genes diana y no podía desempeñar su papel de proliferación.
De hecho, además de sus efectos sobre la expresión ER, no podemos excluir que ERβ también reduce la actividad de ER, como se muestra por transfección de un reportero sensible a estrógenos en las células BG-1. Esto está de acuerdo con un estudio previo realizado en un líneas celulares de cáncer de mama ER-positivo en el que se transfectó ERβ, lo que sugiere que ER y ERβ tienen funciones distintas [47]. A su vez, esto podría afectar a la señalización dependiente de E2 de ER, que no podía regular los niveles de la actividad de los genes diana clave que participan en la proliferación, tales como AKT, Rb, ciclina D1 o ciclina A2. Por otra parte, otros estudios han informado de una acción negativa de ERβ en ER señalización [44], [48]. En particular, ERβ se ha demostrado que altera el reclutamiento de AP-1 complejos a ER genes diana [44], que se sabe que actúan en sinergia con ER. Una vez heterodimerized con ER, ERβ también podría modificar la capacidad de ER para interactuar con coactivadores. Un estudio previo ha sugerido también una acción de Ying Yang de ERβ
in vivo
, que es un represor de ER de señalización en presencia de ER, pero también puede reemplazar ER en ausencia de ER [48]. La regulación a la baja de la expresión de ER por ERβ puede no ser el único mecanismo de inhibición del crecimiento por ERβ, como ERβ también puede reducir el crecimiento celular de células ER-negativos PEO-14. Es posible que ERβ afectan directamente a los factores implicados en la proliferación celular, como coregulators transcripción, reguladores del ciclo celular, sino también factores de crecimiento.
Nos informan de que ERβ no sólo podría reducir el crecimiento del tumor primario, pero también podría disminuir la extensión de la metástasis, o al menos la presencia de células tumorales en los diferentes órganos. Hemos demostrado previamente que el ERβ podría inhibir
in vitro de células de cáncer
invasión en [31], lo que sin duda explica la difusión disminución observada. Sin embargo, no podemos excluir completamente la posibilidad de que la reducción del crecimiento del tumor primario conduce también a una metástasis disminuido. Cualquiera que sea el efecto ejercido por ERβ, esta reducción de la metástasis sin duda explica el aumento de la supervivencia de los ratones implantados con células ERβ.
En conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia de un escenario en el que ERβ actúa como un potencial supresor de tumores y representa un objetivo potencial para futuras terapias de EOC. Para nuestro conocimiento, este es el primer
in vivo
demostración de las acciones anti-proliferativos y -metastatic de ERβ en un modelo ortotópico preclínica de la carcinogénesis ovárica. Nuestros resultados enlazan ERβ y el proceso mestastasis están en completo acuerdo con los estudios clínicos que revelan que ERβ no se expresa en las formas metastásicas de cáncer de ovario [20] y la pérdida de su expresión se correlaciona con una supervivencia global más corta [23]. Aquí, además, que desentrañar ERβ impacta directamente sobre la expresión de ER, el ciclo celular y las propiedades invasivas de las células cancerosas. Las razones que explican la débil expresión de ERβ en el cáncer de ovario sigue siendo difícil. Informes recientes sugieren posibles modificaciones epigenéticas que conducen a
ERβ
silenciamiento, como el tratamiento de las células del cáncer de ovario con ADN metiltransferasa o inhibidores de histona deacetilasa podría restaurar su expresión [49], [50], [51]. Otra hipótesis sería una degradación preferencial de la proteína ERβ por el proteasoma, lo que resulta en bajos niveles de este receptor en las células del cáncer [32]. Estas podrían ser las vías para explorar en el futuro para controlar la expresión de ERβ y el desarrollo de nuevas terapias en el cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Línea celular tumoral
La célula de ovario humano