Extracto
descubrimiento de biomarcadores mediante espectrometría de masas (MS) se ha visto recientemente un aumento significativo de solicitudes, impulsado principalmente por el campo en rápido avance de la metabolómica. avances instrumentales y de manipulación de datos han permitido análisis que interrogar simultáneamente múltiples vías bioquímicas para dilucidar fenotipos de la enfermedad y los mecanismos terapéuticos metabolito no directo. Aunque la mayoría de los enfoques basados en MS metabolómica se acoplan con cromatografía de líquidos, algunos estudios publicados recientemente utilizados desorción por láser asistida por matriz (MALDI), lo que permite el análisis de muestras rápida y directa con la preparación de muestras mínima. Nosotros y otros han informado de que la prostaglandina E
3 (PGE
3), derivado de la COX-2 metabolismo del ácido graso eicosapentaenoico ácido omega-3 (EPA), inhibió la proliferación de pulmón humano, colon y cáncer de páncreas Células. Sin embargo, ¿cómo PGE
3 se regula el metabolismo en las células cancerosas, particularmente células humanas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), no se entiende completamente. En este caso, hemos utilizado con éxito MALDI para identificar las diferencias en el metabolismo lipídico entre dos líneas celulares de células no pequeñas de cáncer de pulmón humano (NSCLC), A549 y H596, que podrían contribuir a su respuesta diferencial al tratamiento de la EPA. El análisis por MALDI-MS mostró que el nivel de EPA incorporado en los fosfolípidos en las células H596 fue 4 veces mayor que las células A549. Curiosamente, H596 células producen mucho menos PGE
3 que las células A549 a pesar de que la expresión de COX-2 fue similar en estas dos líneas celulares. Esto parece ser debido a la expresión relativamente baja de la fosfolipasa citosólica A
2 (la cPLA
2) en células H596 que la de las células A549. Además, el enfoque de MALDI-MS fue utilizado con éxito en extractos de tejido tumoral de un modelo de ratón transgénico K-ras de cáncer de pulmón para mejorar nuestra comprensión del mecanismo de acción de EPA en el
in vivo
modelo. Estos resultados ponen de manifiesto la utilidad de la combinación de un flujo de trabajo con la metabolómica MALDI-MS para identificar los biomarcadores que pueden regular el metabolismo de los ácidos grasos omega-3 y en última instancia afectar a sus potenciales terapéuticos
Visto:. Pirman DA, Efuet E, Ding XP, Pan Y, Tan L, Fischer SM, et al. (2013) Los cambios en el metabolismo celular del cáncer revela el análisis de la muestra directa con espectrometría de masas MALDI. PLoS ONE 8 (4): e61379. doi: 10.1371 /journal.pone.0061379
Editor: Julio Francisco Turrens, Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado: March 8, 2013; Publicado: 26 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Pirman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención CA144053-01A1. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Mientras tanto esfuerzo se ha dedicado al perfil genómico que conduce a la identificación de ciertos componentes genéticos de cáncer, información sobre la metabolómica y lipidomics en células o tejidos cancerosos es limitado. A pesar de que la metabolómica y lipidomics plantean desafíos tecnológicos en términos de capacidad de instrumento, reproducibilidad, y la manipulación de datos, estos campos de estudio muestran una gran promesa en un panorama global del metabolismo de una célula de cáncer, lo que conduce a nuevas terapias personalizadas y potencialmente.
Los recientes avances en la desorción por láser asistida por matriz /ionización (MALDI) espectrometría de masas (MS), [1] - [7] han aumentado la utilidad de MALDI través de una amplia gama de nuevas aplicaciones. Los avances en la instrumentación disponible en el mercado, incluyendo MALDI acoplado a la trampa de iones lineal instrumento Orbitrap o cuadripolares-tiempo-de-vuelo espectrómetros (QTOF) de masas han permitido la generación con éxito de los espectros de masas en los rangos de menor masa (& lt; 1000 Daltons), permitiendo de este modo MALDI-MS de perfiles de metabolitos, incluyendo lípidos, típicamente no comunes con la instrumentación MALDI debido a los efectos de la matriz y la fragmentación de origen [7] - [9]. Estos avances en la MS y la instrumentación de ionización se han movido MALDI-MS en numerosos campos de investigación nuevos, incluyendo lipidomics [7], [10] - [12], el péptido [2], las drogas [13] - [16], y de metabolitos [17 ] análisis directamente a partir de muestras biológicas, incluyendo tejidos.
MALDI-MS recientemente se ha utilizado con éxito para analizar directamente las muestras biológicas combinadas con el manejo de datos estadísticos. Estos enfoques pueden ser utilizados para diferenciar los tipos de tejidos o identificar vías de metabolismo regulados diferencialmente. Por ejemplo, las sondas intra-quirúrgico está siendo desarrollado por Balgo,
et al
., En la que el tejido se muestrea durante la resección quirúrgica, se analizó por MS, a continuación, se pueden categorizar con software estadístico [18]. Este enfoque ha permitido la rápida discriminación, no sesgada de tejido enfermo y sano y potencialmente podría utilizarse para sustituir la clasificación histológica tradicional durante la resección quirúrgica de un tumor. Recientemente, MALDI-MS también se ha utilizado para clasificar los grados de tumor, así como el origen del tumor, aunque no intrasurgically [5], [19] - [21]. Estos estudios publicados recientemente ponen de manifiesto la expansión del uso de MALDI-MS para el análisis directo de tejidos para caracterizar tejidos en función de sus perfiles de metabolitos, lípidos, péptidos y proteínas.
En el presente estudio, hemos utilizado MALDI acoplado a un espectrómetro de masas QTOF para la rápida interrogatorio de dos líneas celulares de NSCLC para revelar diferencias en el metabolismo celular del ácido eicosapentaenoico derivados de aceite de pescado, ácidos grasos poli-insaturados (PUFA) (EPA). también Se adaptó la técnica para analizar directamente y caracterizar el metabolismo de lípidos de tejidos de EPA a partir de tumores transgénico de pulmón de ratón K-ras tratados con EPA tanto por cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas tándem (LC-MS /MS) y MALDI-MS para verificar la
in vitro
datos MALDI utilizando un enfoque complementario.
Numerosos estudios preclínicos han apoyado la idea de que los ácidos grasos omega-3 de aceite de pescado derivados de EPA y ácido docosahexaenoico (DHA) tienen la capacidad de prevenir la proliferación de células de cáncer, la migración y la invasión en varios tipos de tumores, incluyendo NSCLC [22]. Nosotros y otros investigadores han informado de que la eficacia de la EPA podría estar mediado a través de su ciclooxigenasa (COX) metabolito de la prostaglandina E
3 (PGE
3) en pulmón humano, colon, y las células de cáncer de páncreas [23] - [25 ]. En contraste con DHA, EPA también puede actuar como un sustrato de la COX, en especial de la COX-2, lo que lleva a un aumento de PGE
3 en comparación con el ácido araquidónico (AA), que da lugar a la pro-inflamatoria metabolito de la prostaglandina E
2 (PGE
2) (Fig. 1) [22]. Los altos niveles de actividad de la COX-2, y por lo tanto la PGE
2, se sabe que están asociados con un aumento de la proliferación celular y el potencial metastásico en tumores [26] - [28]. EPA ha sido previamente demostrado ser eficaz en la reducción de la proliferación de células A549 mediante el aumento de la producción de PGE
3 y, por tanto, el aumento de la PGE PGE 2 relación
3 /
[22]. Sin embargo, ¿cómo otros factores asociados con la síntesis de prostaglandinas afectan el efecto anticancerígeno de la EPA en las células NSCLC no ha sido evaluado completamente.
En este documento, el uso de MALDI-MS en dos líneas celulares de cáncer que expresan niveles similares de la COX-2, se identifican con éxito las diferencias en el metabolismo celular de EPA. Con esta técnica, hemos sido capaces de directa y rápidamente (tiempo de análisis & lt; 30 segundos) interrogan el metabolismo diferencial, en particular el metabolismo de lípidos, en cada línea de células de una manera reproducible. Different metabolismo de los lípidos derivados de EPA también se observó en los tejidos tumorales de pulmón derivados de los
K-ras
ratón mutante. Estudios anteriores han demostrado éxito perfiles de proteínas de los subtipos de cáncer de pulmón humano mediante MALDI-MS [29], pero aquí hemos demostrado el potencial de MALDI para no sólo discriminar subtipos de cáncer por sus perfiles de lípidos distintas pero también para el seguimiento de la eficacia biológica de tratamiento a través de la identificación biomarcadores de los adecuados. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para analizar directamente las células cancerosas por MALDI-MS, que revelan diferencias en el metabolismo celular, lo que podría ser crítico para la EPA-suscitó actividades contra el cáncer en las células NSCLC.
Métodos
las líneas celulares
el cáncer de pulmón de células no pequeñas humano se obtuvieron (NSCLC) células A549 y H596 de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. células A549 y H596 fueron rutinariamente cultivadas en DMEM /F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 5% y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EE.UU.), respectivamente, y la penicilina -Streptomycin 100 × solución y 2 mM de L-glutamina de GIBCO (Invitrogen).
inmunotransferencia
Por Western blot, las células en un 70% de confluencia se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) , tripsinizaron y se recogieron los sedimentos celulares. El sedimento se lavó dos veces con PBS frío y el sedimento resultante se resuspendió en tampón de lisis (Invitrogen), se sonicó inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C. Los lisados celulares se sometieron a ultrasonidos en hielo durante 3 min (Misonix Sonicator 3000, Farmingdale, NY, EE.UU.), y se centrifuga a 14.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Los niveles de proteína se cuantificaron mediante el ensayo de proteína BioRad Dc (BioRad, Inc., Hercules, CA). La igualdad de los niveles de proteína (50 mg) se resolvieron en 7% (la cPLA
2) y 10% geles (COX-2) SDS PAGE y después se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno, de acuerdo con métodos estándar. Después de una incubación de 2 horas en leche en polvo sin grasa 5% de tampón preparado en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 (TBST) de bloqueo, las membranas se probaron con la cPLA
2 anticuerpo primario (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) o de la COX-2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.) a una dilución 1:1000 durante 2 horas, se lavaron en TBST, se incubaron en la secundaria de anticuerpos durante 1 hora, seguido de 3 x 10 min lavan cada uno en TBST. Las bandas de proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia utilizando el kit ECL + detección e hiper-película (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). La igualdad de carga de las muestras se ilustra mediante Western blot para la presencia de β-actina.
la cPLA
2 Ensayo de actividad
La actividad de la cPLA se determinó
2 usando un la cPLA
2 kit de ensayo (Cayman Chemical Company). Brevemente, A549 y H596 (5 × 10
6) células se sembraron en 100 mm platos y se dejaron crecer durante la noche para llegar a ~ 70% de confluencia. Las células se lavaron dos veces con tampón frío (Hepes 50 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM), rasparon con un levantador celular (Corning Incorporated, Corning, NY, EE.UU.) y se transfirieron a un tubo Eppendorf en hielo. Después de sonicación durante 3 min, los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Se eliminó el sobrenadante y la concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de proteína BioRad Dc. Para el ensayo de actividad, se utilizó el equivalente volumen de 1 g de proteína. La absorbancia se leyó a 414 nm en un lector de placas Spectra Max M5 (Molecular Devices Corp., Sunnyville, CA, EE.UU.). El la cPLA
2 la actividad se expresa en mol /min /ml como se determina por la fórmula prevista en el protocolo del fabricante.
K-ras ratón transgénico
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Cuidado de Animales y el empleo en la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center. Para evaluar el metabolismo de los lípidos de EPA en los tejidos del pulmón de ratón, de cinco semanas de edad
K-RASLA
C57Bl6 /129 /sv F1 ratones mutantes se utilizaron como un modelo de tumor de pulmón espontánea y alimentados con una dieta que contenía aceite de soja o EPA (1% y 2%) durante 9 semanas. Al final de la novena semana, los ratones se sacrificaron, los tejidos pulmonares se retiraron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior análisis por MALDI-MS.
Análisis por MALDI MS
Las células (1 × 10
6) se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche. Las células se trataron luego con EPA (25, 50, o 100 mM), en medio libre de suero que contenía 1% de BSA durante 24 hrs. Al final del periodo de incubación, las células intactas se recogieron por tripsinización, se centrifugaron a 3000 rpm durante 2 min a 4 ° C, se lavaron en PBS, y el sedimento celular se resuspendió en 20 l de PBS. Las células se almacenaron a -80 ° C o inmediatamente procesadas para el análisis de MALDI-MS.
Para el análisis de MALDI-MS de las células, los sedimentos celulares se descongelaron y 1 l de la suspensión fue descubierto en una polilisina-revestido portaobjetos de vidrio (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) usando como objetivo MALDI. Para los análisis de MALDI-MS de muestras de tejido, 10 a 30 mg de tejido se homogeneizó en 500 l de PBS usando un homogeneizador de tejidos Precellys (Bertin Technologies, París, Francia). Una alícuota de 1 l del homogeneizado fue descubierto en un portaobjetos de vidrio recubiertos con polilisina. Las suspensiones celulares y homogeneizado de tejido se secaron en un desecador de vacío a temperatura ambiente durante 10 min. dihidroxibenzoico (DHB) (20 mg /ml) en cloroformo /etanol (09:01;
v /v
) se aplicó a las muestras de revestimiento de pulverización a través de un nebulizador Meinhard (Meinhard, Golden, CO, ESTADOS UNIDOS). La mezcla de cloroformo /etanol permitió la formación de cristales rápida sobre las células, mientras que la prevención de la puesta en común del disolvente de la matriz. Los espectros de masas se recogieron en un espectrómetro de masas Waters SYNAPT G1 QTOF (Milford, MA, EE.UU.). Para la identificación de los lípidos, se recogieron los datos de masa exacta y MALDI-MS /MS en un espectrómetro de masas MALDI Thermo Scientific LTQ Orbitrap (San Jose, CA, EE.UU.).
LC-MS /MS
las prostaglandinas e
2 y e
3 (PGE
2 y PGE
3), se extrajeron según el método publicado previamente de Yang
et al
. [30], [31]. Brevemente, se añadió una parte alícuota de la memoria intermedia de 0,5 ml de PBS a las células o tejidos gránulos congelados, seguido de homogeneización en tubos de 1,5 mL con cuentas de cerámica utilizando el homogeneizador de tejidos Precellys (Bertin Technologies) y alícuotas de 400 mu L se utilizaron para la extracción de la prostaglandina. Todos los procedimientos de extracción se realizaron bajo luz mínima. Las muestras fueron luego reconstituidas en 100 l de ácido acético en metanol /0,1% (50:50,
v /v
) antes del análisis por LC-MS /MS [31].
El extracelular niveles de PGE
2 y PGE
3 en las células A549 y H596 se extrajeron según Yang
et al
[22]. PGE
2 y PGE
3 se cuantificó mediante LC-MS /MS utilizando un Agilent 6460 de triple cuadrupolo (QqQ) espectrómetro de masas (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) equipado con un 1,200 HPLC bomba binaria Agilent HP de entrada (Agilent). PGE
2 y PGE
3 fueron separados utilizando un 2 × 100 mm Kinetex 3 μ C18 columna analítica (Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.). La fase móvil consistió en ácido fórmico 0,1% y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 ° C, y las muestras se mantuvieron a 4 ° C durante el análisis. analitos individuales se detectaron mediante ionización por electrospray y monitoreo de reacciones múltiples, y la siguiente
m /z
transiciones fueron controlados en el modo de ionización negativa con:
m /z 351 → 271
de PGE
2,
m /z 349 → 269
de PGE
3, y
m /z 355 → 275
de PGE
2-D
4. Los niveles de PGE
2 y PGE
3 se cuantificaron utilizando curvas patrón auténticos y normalizado a ya sea el número de células (intracelular o extracelular) o la cantidad de proteína determinada por un ensayo de Bradford (Bio-Rad).
el análisis estadístico
Cada replica biológica fue visto dos veces y dos veces analizó por MALDI-MS y los experimentos se repitieron tres veces. Los espectros exportado de cada grupo fueron cargados en el software en línea Metaboanalyst (Metaboanalysis 2.0, disponible:. http://www.metaboanalyst.ca/Consultado mayo de 2012) [32], [33]. Este software en línea ofrece una variedad de herramientas estadísticas para reducir el complejo de espectros e identificar de manera significativa el cambio de
m /z
valores. El análisis de componentes principales (PCA), análisis parcial de mínimos cuadrados discriminar, pruebas t, y el análisis de varianza se utilizó para analizar los datos de MS resultantes tanto para determinar los cambios en los picos y determinar si los tipos de células o tejidos pueden ser discriminados unos de otros . Significativamente diferentes características se compararon con los de tanto el Banco de Datos de Metaboloma Humano (HMDB; Disponible: http://www.hmdb.ca Consultado mayo de 2012.) Y el METLIN (Disponible: http://metlin.scripps.edu/. Consultado mayo de 2012) la base de datos para la caracterización del compuesto.
resultados
metabolismo de la EPA fue regulada diferencialmente en NSCLC A549 y células H596
Como se informó anteriormente, el efecto antiproliferativo de EPA en células de NSCLC humanos estaban mediadas a través de su expresión de COX-2 y la formación del metabolito anti-proliferativa, PGE
3 [22]. Sin embargo, cuando se trataron dos NSCLC A549 y H596 células con EPA, EPA inhibe la proliferación de células A549 (CI
50 & lt; 6,25 M) de manera más eficaz de lo que hizo que las células H596 (IC
50 & gt; 50 M) ( Fig. 2A) a pesar de que estas dos líneas celulares mostró similares COX-2 expresión (Fig. 2B). Para delinear los mecanismos que median los efectos diferenciales observaron con tratamiento EPA, se evaluaron los diferentes perfiles del espectro de masas de estas líneas celulares usando MALDI-MS seguido de análisis PCA (Fig. 3). Inicialmente, este análisis se utiliza simplemente para determinar si la MS espectros recogidos de hecho se podría utilizar para discriminar entre el tipo de célula y tratados frente a muestras no tratadas. Es significativo que el cambio de picos identificados por los valores de p & lt; 0,05 se investigaron e identificación intentaron incluyendo los lípidos de PC se discute más extensamente. El MALDI-MS espectros de las células A549 y H596 no tratados mostró metabólicas /firmas lipidomic muy similares (Fig. S1A y S1B) aparte de algunas pequeñas variaciones en la intensidad de la señal y por lo tanto no se diferencia por análisis de componentes principales, las células A549 y H596 EPA tratados diferían sustancialmente en su metabólica /perfiles lipidomic (Fig. 4). Después del tratamiento EPA, el patrón de metabolito en las dos líneas celulares se diferencia fácilmente mediante la observación de novela y hasta regulado picos, lo que sugiere que el metabolismo celular de EPA en estas dos líneas celulares se diferencialmente regulada (Fig. S1C y S1D).
(A). El efecto anti-proliferativo de EPA en células no pequeñas humano A549 del cáncer de pulmón y las células H596 (B). La exposición de células A549 a EPA durante 72 horas produjo un diez veces más fuerte inhibición de la proliferación celular en células A549 que en H596 células.
Las células se dejaron sin tratar (A) y se trató con 50 mM EPA ( SEGUNDO). células A549 y H596 no tratados tenían espectros de masa similar (A). Sin embargo, el tratamiento post-EPA condujo a un patrón metabólico claramente diferenciada entre estas dos líneas celulares (B). Los datos son representativos de dos repeticiones biológica con análisis repetidos. Un promedio de 25 espectros de masas se recogieron y se promedió a partir de cada punto de la célula. La cantidad de tiempo para cada análisis fue de menos de un minuto. Los datos se representaron a partir de tres experimentos replicados.
Un aumento significativo se observa para
m /z 802,5
, que corresponde a un PC (36:5) de ácido graso. MS /MS confirmó que PC (16:00 /20:05) era un componente de la
m /z
valor observado (datos no mostrados). Spectra se muestra en (C) y (D), correspondiente a las células A549 se alinean sin tratar y tratada EPA; respectivamente, también muestran un aumento en
m /z 802,5
después del tratamiento con EPA. Sin embargo, este aumento es significativamente menor que el aumento observado en la línea celular H596.
Mayor nivel de EPA incorporación en fosfatidilcolina (PC) en H596 que en las células A549
Además de inspección de los espectros recogidos ofrece información sobre el metabolismo EPA diferencialmente regulados en estas dos líneas de células particulares, que se muestra en la Fig. 4. Los picos que se muestran en esta figura representan especies de lípidos con dos diferentes longitudes de cadena de acilo y grados de insaturación. Por ejemplo,
m /z 804,5
representa la PC sodiated que contiene dos cadenas de acilo por un total de 36 carbonos con 4 dobles enlaces (36:4). De los resultados publicados anteriormente, una suposición razonable se puede hacer que una sola cadena de acilo contiene 16 átomos de carbono con dobles enlaces cero y que la otra cadena contiene 20 átomos de carbono y cuatro dobles enlaces (un resto AA) [7]. Más comúnmente, el resto insaturado ocupa la posición SN2 en la columna vertebral fosfoglicerol; Sin embargo, como la degradación de los lípidos y la regeneración es continuamente en flujo, las estructuras están cambiando continuamente, haciendo absolutos determinaciones estructurales de lípidos difícil en un momento dado. Higo. 4B muestra también un aumento de cinco veces en
m /z 802,5
, [M + Na]
+ de la PC en células H596 después del tratamiento con EPA en comparación con la de las células tratadas con vehículo solo. Un análisis más detallado de MALDI-MS /MS identificó esta masa que consiste de hecho de un PC muy probablemente derivado de EPA como PC (36:5) (Fig. S2). El aumento observado de PC (36:5) se atribuye a la incorporación de los ácidos grasos EPA en el PC, posiblemente en la posición SN2. En comparación, el metabolito similar a partir de las células A549 (Fig. 4C y 4D) muestra sólo un aumento marginal en
m /z 802,5
. Por lo tanto, estas diferencias en el metabolismo celular específicamente se pueden correlacionar con H596 células por tratamiento EPA. Comparación de los espectros de célula no tratada de la PC (36:4) intensidades en ambas líneas celulares resultó en valores similares, indicando estas dos líneas celulares tienen capacidad similar para formar dichas especies de PC. Este resultado sugiere que las células A549 y H596 difieren mínimamente en la biosíntesis de PC, pero podrían tener diferentes capacidades para regular la utilización de la EPA desde el PC.
Para generar estimaciones comparables entre las dos líneas celulares y para dar cuenta de cualquier MALDI las variaciones de intensidad de señal, cada PC de ácidos grasos (
m /z
802 y 804) se normalizó a la intensidad de la señal del grupo de cabeza de la PC (
m /z
184), que principalmente a través de las formas fragmentación fuente. Suponiendo que el contenido total de PC entre las dos líneas celulares es similar, este ion sirve como un ion de normalización adecuado, ya que puede ser usado para representar toda la especie de PC. Este enfoque se limita a las especies de PC con una cadena de acilo 16:00 en la posición SN1 y la sustitución PUFA en la posición SN2 de la simplicidad de la comparación. Cálculos similares se podrían hacer con el aumento de SN1 longitud de cadena de acilo. A partir de los cálculos, un aumento significativo en PC (36:5) y PC (36:4) se observa en células H596 después del tratamiento con EPA (Tabla 1). El aumento de la PC (36:5) se puede atribuir a la formación de especies de PC con un resto EPA añadido en la posición SN2 de los grupos de PC. El aumento en el PC (36:4) es indicativa de la alejamiento de AA de entrar en la vía de la COX-2 hacia la de EPA. Un incremento en ambas especies de PC también se observa en la línea celular A549; Sin embargo, este efecto no es tan profunda como la que se observa en la línea celular H596.
H596 generados menores niveles de PGE
3 que hizo las células A549
Desde el MALDI MS datos sugieren que EPA se observó principalmente en una forma de fosfolípidos en H596 células, pero no en las células A549 y los dos de estas células tienen la capacidad de biosíntesis de fosfolípidos similares, nuestra hipótesis actual es que puede haber diferencias en cualquiera de la expresión o actividad de la fosfolipasa a
2 (la cPLA
2), una enzima que libera ácidos grasos desde la posición SN2 de la cadena principal de glicerol. Esta alteración podría dar lugar a las diferentes capacidades de H596 y A549 células para formar PGE
3 de la disponibilidad de sustrato, lo que limita los efectos antiproliferativos de la EPA en las células H596.
En primer lugar, comparamos la intracelular y los niveles extracelulares de PGE
3 en H596 y A549 células tratadas con la EPA (50 mM). Como se muestra en la Fig. 5, el nivel intracelular de PGE
3 era casi de dos a cuatro veces mayor, en los puntos de tiempo hasta 20 horas en las células A549 que en las células H596, mientras que una mayor cantidad de PGE extracelular
3 era observado en células A549 que en células H596 después de 4 horas de tratamiento. A fin de probar nuestra hipótesis, se determinó el nivel de proteína de la cPLA
2, así como su actividad en estas células. Como se muestra en la figura 6., la expresión de la proteína de la cPLA
2 fue notablemente mayor en las células A549 que la de H596 células (Fig. 6A). Del mismo modo, la actividad de la cPLA
2 era 4 veces mayor en las células A549 que la de H596 células (Fig. 6B). En conjunto, estos datos sugieren que la liberación de EPA en H596 células de PC incorporado-EPA fue mucho menor que en las células A549 debido a la expresión y la actividad de la cPLA limitada
2 en H596 células, apoyando la hipótesis de que el metabolismo EPA está regulada diferencialmente , como se sugiere por el análisis MALDI-MS.
las células (a) se trataron con EPA para diferentes tiempos como se indica y las células intactas se recogieron por tripsinización y se sometieron a análisis por LC-MS /MS. Los niveles intracelulares de PGE
3 en las células A549 fueron al menos dos veces mayor que los de células H596. se recogieron (B) medios de cultivo celular en diferentes momentos como se indica y se sometió a extracción en fase sólida. los niveles extracelulares de PGE
3 A continuación se analizaron por LC-MS /MS. Los datos son representativos de dos experimentos separados
(A) Expresión de proteínas de cPLA2 en células A549 y H596 se determinó mediante Western Blot.; (B) Actividad de cPLA2 en células A549 y H596 se midió como se describió anteriormente. Tanto el nivel de proteína y la actividad de cPLA2 fueron significativamente más bajos en las células H596 en comparación con la de las células A549.
EPA alterado metabolismo de los lípidos en los tejidos tumorales de pulmón de ratón K-ras
Para determinar si MALDI-MS podría ser utilizada para observar los cambios en el metabolismo del tejido
in vivo
, después del consumo dietético de EPA, también se realizaron experimentos en los extractos de tejido pulmonar de genéticos K-ras ratones mutantes. Los espectros de masas obtenidos directamente a partir de tejido de pulmón que van desde
m /z
800-840 se muestran en la Fig. 7. A partir del análisis directo de tejidos con MALDI, el efecto de cada dieta se puede observar a partir de los perfiles de lípidos del tumor. Después de alimentar a EPA (Fig. 7A), las correspondientes especies de PC con la EPA (
m /z
802 y 830) acil-grupo se upregulated en comparación con los que en el grupo de la dieta de soja. Curiosamente, la relación de PGE
3 sobre PGE
2 se incrementó significativamente de 0.011 ± 0.004 de los tejidos de ratones de soja alimentados a 0,063 ± 0,03 (1% EPA) y 0,42 ± 0,11 (2% de EPA) de pulmón tejidos derivados de los ratones alimentados con EPA (Fig. 7B). La observación de EPA incorporación en las especies de PC se correlacionaban bien con la proporción de PGE
3 /PGE
2 detectada a partir de las mismas muestras de tejido por LC-MS /MS, lo que sugiere que la EPA condujo a cambio del tumor en el metabolismo de producir el metabolito proliferativa PGE
2 a metabolito anti-proliferativa PGE
3 a través de la vía de la COX-2.
a). Los espectros de masas MALDI recoge directamente a partir de lisados de tejido tumoral de K-ras mutante tumores de pulmón, ya sea sin tratar o tratados con EPA. los cambios observados en el catabolismo de los lípidos de AA a EPA están en caja, que muestra cambios significativos en el metabolismo del tumor. SEGUNDO). Ratio de PGE
3 /PGE
2 extraído de tejido tumoral derivado del modelo de ratón transgénico K-ras. PGE
2 y PGE
3 se cuantificó mediante LC-MS /MS. Estos datos representan cambio de metabolismo del tumor desde la producción de AA derivado de PGE
2 a PGE
3 de la EPA provocando así un efecto antiproliferativo.
Discusión
El primer objetivo de este estudio fue determinar si la respuesta diferencial de las líneas celulares de cáncer a tratamiento EPA podría medirse por análisis directo de MALDI-MS. Aunque las herramientas estadísticas empleadas no pudo discriminar directamente entre las dos líneas celulares antes del tratamiento, podríamos diferenciar con éxito las líneas de células en base a sus perfiles de espectros de masa después del tratamiento EPA. Estos datos han llevado a una mayor comprensión de los mecanismos biológicos responsables de relativamente menor sensibilidad de las células H596 'al tratamiento EPA que la de las células A549, a pesar de que la expresión de la proteína COX-2 fue similar en ambas líneas celulares. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para analizar directamente las células cancerosas por MALDI-MS, que revela diferencias en el metabolismo celular, que podría ser un índice para actividades contra el cáncer provocados por la EPA en células de NSCLC. Este sencillo método MALDI-MS permitido para el interrogatorio de la vías que operan en líneas celulares de cáncer de señalización de lípidos.
Durante el uso de MALDI-MS sin separación analítica tiene numerosos inconvenientes, incluyendo la supresión de iones, iones matriz interferir MALDI, y la incapacidad para separar las especies endógenas isobáricas, la técnica todavía tiene un gran potencial en su capacidad para mediciones directas de muestras biológicas. Esto ha puesto de manifiesto en el reciente crecimiento de las aplicaciones de imágenes MALDI MS [34]. Nuevos avances en el análisis biológico directo mediante técnicas de MS, tales como técnicas de ionización libre de la matriz o técnicas de desorción atmosféricos, permitirán una mayor amplitud de la cobertura y la metabolómica. Lipidomic
Estas técnicas pueden ser especialmente útiles cuando se combinan cuantitativa clásica enfoques orientados metabolómica. Como se informó aquí, el uso de MALDI-MS para investigar las diferencias en el metabolismo de lípidos después de tratar las células con EPA ha llevado a una posible caracterización del fenotipo de la NSCLC A549 y H596 células. Además, el cambio metabólico similar en H596 y células A549 también se observó en las células que está siendo tratado con ácido araquidónico, es decir, la intensidad de pico de la PC (36:4), PC-AA incorporada, era mayor en las células H596 que en las células A549 (datos no mostrados). Por lo tanto, estos resultados sugieren que los patrones metabólicos diferenciales generados en las células no se sustraen dependiente, en lugar más probable era dependiente del fenotipo de estas dos líneas celulares. Los resultados de MALDI-MS fueron corroboradas por más interrogatorios de la vía de la COX-2 y su metabolito EPA PGE
3 cuantitativa utilizando LC-MS /MS. Dado que los ácidos grasos, tales como EPA o AA, deben ser liberados de los fosfolípidos en la membrana por la cPLA
2 a fin de que puedan ser utilizados por la COX o lipoxigenasas, estos datos sugieren que la cPLA
2 está regulada diferencialmente en estos dos células de NSCLC. De hecho, se observó tanto la expresión y la actividad de la cPLA
2 inferior en H596 que la de las células A549. Actualmente estamos evaluando si la cPLA
2 es crítica para la actividad anti-proliferativa provocada por la EPA a través de su metabolito COX-2 PGE
3 en las células NSCLC.
Las herramientas estadísticas nos usó guiados en la discriminación entre estas líneas celulares y ayudaron a identificar una diferencia en metabolitos entre los grupos de tratamiento. PCA y discriminar análisis (datos no mostrados) se utilizaron como una herramienta preliminar para identificar simplemente las diferencias en los espectros de masas de células o tejidos con o sin tratamiento de la EPA. Hemos sido capaces de identificar algunas de las características correspondientes a estas diferencias, pero la interpretación de espectros de masas directa se utilizó finalmente.