Extracto
vacunas contra el cáncer de próstata humano y del gen ensayos de terapia utilizando
ex vivo
métodos a células dendríticas primos (DCS) con antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) han tenido cierto éxito, pero hasta la fecha el largo
ex vivo
manipulación de los países en desarrollo, ha limitado la utilidad clínica generalizada de este enfoque. Nuestro objetivo era mejorar tras la vacunación con antígenos tumorales del cáncer mediante la entrega de PSMA
a través de
un vector de adenovirus-CD40 dirigido directamente a los DC como un medio eficaz para la activación y la presentación de antígenos a las células T. Para probar este enfoque, hemos desarrollado un modelo de ratón de cáncer de próstata mediante la generación de derivados clonales de la línea celular de cáncer de próstata de ratón RM-1 que expresan PSMA humano (células RM-1-PSMA). Para maximizar la presentación de antígenos en las células diana, tanto en la expresión de MHC de clase I y la proteína PAT se indujo en las células RM-1 mediante transducción con un vector Ad que expresa interferón-gamma (
Ad5-IFN
). La administración de las DC infectadas
ex vivo con CD40-dirigidos
Ad5-huPSMA
, así como la inyección intraperitoneal directa del vector, dio como resultado altos niveles de respuestas de CTL específicos de tumores contra RM-1- PSMA células pretratadas con
Ad5-IFN
como células diana. CD40 focalización mejoró significativamente la eficacia antitumoral terapéutico de
Ad5-huPSMA
codificación PSMA cuando se combina con
Ad5-IFN
en el modelo RM-1-PSMA. Estos resultados sugieren que un adenovirus CD-dirigida entregando PSMA puede ser clínicamente eficaz para la inmunoterapia del cáncer de próstata
Visto:. Williams BJ, Bhatia S, Adams LK, Boling S, Carroll JL, Li X-L, et al. (2012) Sobre la base de células dendríticas PSMA La inmunoterapia para el cáncer de próstata El uso de un CD40-Targeted vector de adenovirus. PLoS ONE 7 (10): e46981. doi: 10.1371 /journal.pone.0046981
Editor: Michael P. Bachmann, Carl Gustav Carus-Universidad Técnica de Dresde-, Alemania |
Recibido: 24 Enero, 2012; Aceptado: September 11, 2012; Publicado: 8 Octubre 2012
Copyright: © Williams et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Centro de Feist-Weiller cáncer, el Consorcio de Investigación de Terapia génica de Luisiana, y subvenciones de los Institutos nacionales de Salud-Instituto Nacional del cáncer (2R42-CA114921) y los Institutos nacionales de Salud-Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades infecciosas (5R33-AI076096). Estos proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Imre Kovesdi es Presidente de la Oficina de Administración y Director Ejecutivo de VectorLogics, Inc., David T. Curiel es responsable científico y fundador de VectorLogics, Inc., y Nikolay Korokhov fue empleado como Investigador en VectorLogics, Inc. durante la ejecución de la obra. Este trabajo utiliza la tecnología basado en la Patente de EE.UU. 6.841.540 titulada "Inmunomodulación por modificación genética de las células dendríticas y células B" que implica un vector adenoviral recombinante CD40-dirigida para la manipulación genética de las células dendríticas y las células B. No hay productos en desarrollo, o los productos comercializados están asociados con este trabajo. Este interés en competencia no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de próstata ocupa el segundo lugar entre las muertes relacionadas con el cáncer líderes en los Estados Unidos en los hombres , y un estimado de 240,890 nuevos casos y 33.720 muertes se han producido en el año 2011 [1]. Aunque se dispone de tratamientos para el carcinoma limitado al órgano de la próstata, no existe un método eficaz para tratar la enfermedad recurrente después de una terapia de privación de andrógenos produce un error. Esto exige el desarrollo de nuevas estrategias para combatir esta enfermedad. Los informes recientes sugieren la supresión del crecimiento del tumor de próstata es posibles estrategias después de la inmunización con vacunas que codifican antígenos tumorales [2], [3]. antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) es una proteína de membrana de tipo II con la actividad hidrolasa folato expresa principalmente en el epitelio de la próstata y un número limitado de otros tipos de células. Esta expresión de próstata bien definido es significativamente elevado en el cáncer de próstata, especialmente en etapas avanzadas [4]. Por lo tanto, PSMA es un objetivo potencial favorable para la inmunoterapia del cáncer de próstata. Varias vacunas basadas en PSMA se habían desarrollado y ensayos clínicos indican que estos enfoques de inmunoterapia se pueden administrar de forma segura y pueden inducir respuestas inmunes en pacientes con carcinoma avanzado de próstata [5], [6]. Sin embargo, las respuestas clínicas limitadas observados hasta ahora justifican un paradigma de vacunación alternativa.
Las células dendríticas (DC) son las APCs profesionales que juegan un papel potente en la iniciación de la respuesta inmune mediante la activación de células T. Se sabe que la interacción de las DC a través de CD40 con células auxiliares T que expresan el ligando CD40 (CD40L) puede ayudar en su maduración que a su vez desencadena la respuesta CTL. Los informes anteriores han demostrado que
ex vivo
vacunas basadas en DC pueden inducir respuestas de células T anti-tumorales específicos en pacientes [7], [8], [9]. A pesar de estos éxitos clínicos, este enfoque está limitado de una amplia aplicación clínica debido a la manipulación de los países en desarrollo a través de
ex vivo Francia culture y el antígeno de carga es laborioso, costoso y consume mucho tiempo. Del mismo modo,
ex vivo
DCs preparadas muestran migración limitada a los ganglios linfáticos para la posterior activación de las células T [10]. Este problema ha sido abordado por
In situ Loading de las DC con antígenos asociados a tumores usando vectores virales y no virales [11]. Entre los vectores virales, los vectores adenovirales recombinantes (ADS) han recibido mucha atención para la terapia del cáncer debido a su alta capacidad y robusta expresión de genes [12]. No obstante, los vectores de Ad mal infectan DCs debido a la falta de expresión de la Coxsackie y adenovirus receptor que media la captación infecciosa [13]. Esta limitación podría superarse mediante el uso de una molécula de adaptador biespecífico que comprende una fusión de un dominio extracelular del receptor de receptor de Coxsackie y adenovirus nativo y el ligando CD40 de ratón unido por un motivo de trimerización del bacteriófago T4 fibritin proteína 14,15. Más recientemente, se utilizó con éxito este adaptador para la inmunoterapia basada en DC en un modelo de ratón de melanoma [16], [17]. Sin embargo, otras combinaciones de antígenos tumorales /no han sido probados.
En el presente estudio, se evaluó una vacuna anuncio orientado por células dendríticas que expresan PSMA humano
in vivo
en un modelo de ratón de cáncer de próstata . Hemos generado un modelo inmunocompetentes usando la línea celular de cáncer de próstata RM-1 de ratón que forman tumores en ratones C57BL6 singénicos [18], expresando constitutivamente el antígeno PSMA humano. Aquí, nos muestran que
in vivo
suministro de un vector Ad5 CD40 dirigido conduce a una mayor capacidad de respuesta de las células T citotóxicas y una mayor eficacia terapéutica en este modelo. También demuestran que IFN como un adyuvante inmunológico en nuestro régimen de vacuna aumentó la presentación de antígenos en las células diana y maximiza este efecto.
Se muestra una curva de crecimiento representativo del número de células RM-1 (•) en cultivo con tiempo en comparación con el número de RM-1-PSMA clon 1 células (▾), clon RM-1-PSMA 3 celdas (⧫), y 2 células del clon-1-GFP (RM) ▪. Cada punto de datos representa la media ± error estándar de tres experimentos independientes.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los animales utilizados en este estudio recibieron cuidado humano basa en las directrices establecidas por la Asociación Americana de Veterinaria, así como de acuerdo con el
Guía para el Cuidado y uso de Animales de Laboratorio
(Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio, Washington, DC). Los protocolos experimentales con animales vivos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de LSU Health Sciences Center en Shreveport (protocolo P-10-040). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales, para reducir el número de animales utilizados y utilizar alternativas a los
in vivo
técnicas, si está disponible. Se prepararon
Los extractos de proteínas (20 g) de cada línea celular y se diluyeron con tampón de muestra RIPA. Los extractos se separaron por SDS-PAGE, electrotransferencia sobre nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo PSMA anti-humana dirigida a la secuencia C-terminal de proteínas (A) o un anticuerpo PSMA anti-humana dirigida a la secuencia de la proteína N-terminal (B) , seguido de tratamiento con anti-especie correspondientes conjugados de IgG HRP. Se muestran los borrones representativos tras visualización mediante autorradiografía.
Líneas Celulares
RM-1, una clase de andrógeno-insensible MHC línea celular de cáncer de próstata de ratón deficiente en I-, que es singénico en ratones C57BL /6 ratones [18], se obtuvo del Dr. Timothy C. Thompson (Colegio Baylor de Medicina, Departamento de Urología Scott, Houston, TX). El transformado línea celular de riñón embrionario humano HEK-293 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Las células se mantuvieron a 37 ° C y un 5% de CO humidificado
2 atmósfera en la Dulbecco medio esencial mínimo (DMEM, Mediatech Inc .; Manassas, VA), que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS, Gemini Bioproducts, Woodland, CA) y 1% de solución de antibiótico-antimicótico (Mediatech Inc .; Manassas, VA).
(a) los extractos de proteínas (20 mg) se prepararon a partir de células dendríticas de ratón en cultivo después de la infección de 24 h con el CD40 dirigida
Ad5-luc1
o CD40 orientada
Ad5-mPSMA
ha expresan PSMA ratón o
Ad5-huPSMA
expresan PSMA humano. (B) Los extractos de proteínas (20 mg) se prepararon a partir de células dendríticas de ratón en cultivo después de la infección durante 0, 24, o 48 h con el CD40
Ad5-huPSMA
que expresa PSMA humano. Cada extracto de células se preparó usando tampón de muestra RIPA. Los extractos se separaron por SDS-PAGE, electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo anti-PSMA humano seguido de tratamiento con los correspondientes conjugados de IgG anti-ratón HRP. Se muestra son representativos borrones tras visualización mediante autorradiografía. Un control de carga se utilizó por co-tratamiento de las membranas con un anticuerpo anti-ratón α-tubulina.
Animales
Hombre C57BL /6 ratones a las 4-6 semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
Evaluación de la unión de la clase anti-MHC I (H-2Db y H-2Kb) anticuerpos para (a) RM-1 células parentales, (B) clon 2 células RM-1-GFP, (C) RM-1-PSMA clon 1 en las células, y (D) RM-1-PSMA clon 3 células. Se muestran los picos del histograma correspondiente a las células no tratadas (sombreada) e infectadas con
Ad5-IFN gratis (sin sombra).
Generación de RM-1 células tumorales que expresan PSMA recombinante humana y GFP
promotor 1α subunidad del factor de elongación humano (EF-1α) fue elegido como un promotor del transgén. El PSMA humano y la GFP codificación de secuencias fueron clonados en pEF1 /Myc-Su vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se seleccionaron construcciones con el patrón de restricción correcto y se secuenciaron, y se utilizaron para la transfección de células RM-1. Las células fueron entonces seleccionados por 0,8 mg /ml de G418 (Alexis) durante 2 semanas para obtener un solo clon. Expresión de expresión PSMA humano recombinante en clones resistentes a los antibióticos se determinó mediante análisis de transferencia Western (usando el método descrito a continuación) con un anticuerpos monoclonales anti-PSMA reconocer el N-terminal (7E11C5; previamente purificada a partir de un hibridoma obtenido en ATCC) o el C -terminal (YPSMA-1, Abcam, Cambridge, MA). Dos clones expresaron niveles detectables de PSMA (RM-1-PSMA clon 1 y RM-1-PSMA clon 3). Ellos se propagaron y se congelaron para su posterior análisis. Los clones RM-1 que expresan GFP fueron identificadas por microscopía de fluorescencia. Un clon positivo (RM-1-GFP clon 2) se amplió y se congelaron para su posterior análisis.
Los extractos de proteína (20 mg) se prepararon a partir de cada línea celular y se diluyeron con tampón de muestra RIPA. Los extractos se separaron por SDS-PAGE, electrotransferencia sobre nitrocelulosa y se sondaron con (A) un anticuerpo TAP1 anti-ratón o (B) un anticuerpo anti-ratón TAP2, seguido de tratamiento con un correspondientes conjugados de IgG anti-ratón HRP. Se muestra son representativos borrones tras visualización mediante autorradiografía. Un control de carga se utilizó por co-tratamiento de las membranas con un anticuerpo anti-ratón GAPDH.
Se muestra una curva representativa de la viabilidad celular en las células RM-1 (A) o (B) -PSMA RM-1 clon 3 células infectadas en cultivo con concentraciones crecientes de
Ad5-IFN
comparación con las células no infectadas. Se determinó el efecto de la viabilidad celular en el día 1 (•), el día 2 (▾), el día 3 (⧫), y el día 4 (▪) después del inicio de la infección por
Ad5-IFN
. Cada punto de datos representa la media ± error estándar de tres experimentos independientes.
vectores adenovirales
Ad5-huPSMA
se construyó subclonando la secuencia codificante de ADNc humano PSMA en los MfeI - sitios BstXI del vector lanzadera pAdenoVatorCMV5 (QBIOGENE; Carlsbad, CA). El vector lanzadera pAdenoVatorCMV5-hu-PSMA resultante se utilizó para la construcción de un adenovirus por recombinación homóloga con pAdEasy1 (que contiene la E1 y E3 elimina columna vertebral Ad5) en
E. coli
utilizando los métodos descritos anteriormente [19]. El plásmido recombinante resultante se linealizó con Pac I y se transfectó en células HEK-293 para generar el
Ad5-huPSMA
virus. El
Ad5-luc1
, un serotipo Ad5 humano con el vector que contiene un casete de expresión de luciferasa de luciérnaga en la región E1 eliminada fue proporcionada por el Dr. Igor Dmitriev (Escuela de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO). La
Ad5-IFN
, un Ad humano serotipo 5 vector, que consta de un serotipo 5 humano Ad con E1 suprimido con un promotor de pollo β-actina de conducir la expresión del cDNA de IFN de ratón se proporcionó por el Dr. Hirofumi Hamada (Departamento de Medicina Molecular de la Universidad médica de Sapporo, Sapporo, Japón). Los stocks de adenovirus se propagaron y se amplificaron utilizando la transformada de riñón embrionario humano HEK-293 línea celular. stocks de adenovirus de título alto se purificaron usando un kit de purificación de Adenopure (Puresyn, Inc., Malvern, PA). Después de la purificación de los virus se cuantificaron utilizando un rápido Titer Kit Adeno-X (BD Biosciences, Palo Alto, CA). Los virus se dializaron durante la noche en tampón de diálisis (fosfato de potasio solución salina tamponada que contiene 1 M de sacarosa y 0,5% β-ciclodextrina) a 4 ° C antes de su almacenamiento a -80 ° C.
Los ratones se inmunizaron como se describe en Material y los métodos con células dendríticas infectadas con el objetivo de CD40-
Ad5-luc1
o con el CD40 orientada
Ad5-huPSMA
. Al día 24 después de la iniciación del experimento, los animales fueron sacrificados, y la actividad de CTL se midió en las células cosechadas a partir de los bazos. Las células diana usadas fueron RM-1 parental (•), clon RM-1-PSMA 1 células (▾), clon RM-1-PSMA 3 células (⧫), y células RM-1-GFP clon 2 (▪). Las células diana se dejaron sin tratar (A y C) o pre-tratada por la infección con
Ad5-IFN
(B y D). Cada punto de datos representa la media ± error estándar de cuatro pocillos replicados.
CD40 ligando dirigido
Un adaptador de proteína recombinante molecular consiste en el dominio extracelular soluble del receptor de adenovirus Coxsackie y vinculado al ligando CD40 de ratón a través de un motivo trimerzation (CFm40L) fue construido, producido y purificado como se describe anteriormente [14], y se utiliza para reorientar vectores adenovirales para ratón DC.
los ratones se inmunizaron como se describe en material y Métodos con el objetivo de CD40-
Ad5-luc1
o con el CD40 orientada
Ad5-huPSMA
. Al día 24 después de la iniciación del experimento, los animales fueron sacrificados, y la actividad de CTL se midió en las células cosechadas a partir de los bazos. Como control, se midió la actividad CTL en las células cosechadas a partir de bazos de ratones ingenuos (sin tratar). Las células diana usadas fueron RM-1 parental (•), clon RM-1-PSMA 1 células (▾), clon RM-1-PSMA 3 células (⧫), y células RM-1-GFP clon 2 (▪). Las células diana se dejaron sin tratar (A, C, y E) o pre-tratada por la infección con
Ad5-IFN
(B, D, y F). Cada punto de datos representa la media ± error estándar de cuatro pocillos replicados.
Análisis de transferencia Western de la expresión de TAP
Control de las células RM-1 y células RM-1 se incubaron durante 24 h con
Ad5-IFN
en multiplicidad de infección (MOI) de 100 IFU /célula se recogieron y los lisados se prepararon en tampón de muestra RIPA. Las concentraciones de proteína de las muestras se normalizaron por el ensayo de Bradford. Las muestras se analizaron en electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) geles de 10% de dodecil de sodio y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 h con albúmina de suero bovino 5% (BSA) y se lavaron con TTBS (1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris). Después, las membranas se incubaron con anti-ratón de TAP1, anti-ratón TAP2, o anti-ratón de anticuerpos GAPDH (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) durante 1 h. Después de tres lavados consecutivos con TTBS, las membranas se incubaron con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra durante 1 h, y se lavaron tres veces durante 30 minutos cada uno con TTBS. Finalmente las membranas se desarrollaron usando el sustrato ECL (Amersham; Piscataway, NJ), y se expusieron a película de rayos X
(A) la actividad citotóxica de las células efectoras NK en YAC-1 y RM-1 en las células diana. se determinó mediante un
ensayo de liberación de 51Cr al indicado relaciones E: T. Las células diana empleadas fueron YAC-1 (•), RM-1 parental (▾), RM-1 en las células parentales pre-tratada por la infección por
Ad5-IFN gratis (▪), RM-1-PSMA clon 3 células (⧫), o el clon 3 células RM-1-PSMA pre-tratadas por la infección por
Ad5-IFN gratis (▴). Cada punto de datos representa la media ± error estándar de cuatro pocillos replicados. (B) La citometría de flujo análisis de células YAC-1 y RM-1 teñidas con PE etiquetado anti-H60, anti-MULT-1, o los anticuerpos anti-Rae-1 o con un anticuerpo de control de isotipo. Los números por debajo de los histogramas corresponden a la intensidad media de fluorescencia de cada pico.
Efecto antitumoral de un CD40-dirigidos
Ad5-huPSMA
vacuna se determinó utilizando el modelo de ratón RM-1-PSMA . Los ratones fueron inmunizados como se describe en Materiales y Métodos con el objetivo de CD40-
Ad5-luc1
o CD40 orientada
Ad5-huPSMA
. En el día 24 después del inicio del experimento, cada ratón recibió 4 x 10
6 RM-1 células parentales o células 4 × 10
6 RM-1-PSMA clon 1 inyectadas por vía subcutánea. Tres días más tarde, se inyectaron los grupos de tratamiento en el sitio de inyección de células tumorales con 1 × 10
8 ifu de
Ad5-IFN
o con solución salina normal. Comenzando en el momento de la inoculación de células tumorales (día 0), se midieron los tumores y los volúmenes calculados por la fórmula:
volumen del tumor = ½ ×
(
longitud
×
anchura
2) donde la longitud es la distancia más larga del tumor. Cada punto de datos representa el volumen medio de los tumores de 15 ± error estándar.
Análisis de citometría de flujo de MHC de clase I Expresión
células RM-1 (parental, así como RM-1- clones que expresan PSMA PSMA humano) se analizaron para la expresión de la superficie celular de MHC de clase I (Db y Kb). En pocas palabras, RM-1 células fueron infectadas durante 24 h con
Ad5-IFN
a MOI 100. A las 24 h después de la incubación, se recogieron y se immunostained utilizando un isotiocianato de fluoresceína (FITC) células marcadas anti-ratón H -2Kb /anticuerpo H-2Db (BD Biosciences, San Jose, CA). Este anticuerpo reacciona con el ratón de clase H-2Kb MHC I aloantígeno haplotipo y reacciona de forma cruzada con H-2Db, pero no reacciona con otros haplotipos. Las células se incubaron con el anticuerpo (1:1000 dilución) durante 20 min a 4 ° C y se lavaron 3 veces en PBS enfriado con hielo. Un anticuerpo de isotipo (IgG2a de ratón, κ) también se utilizó para inmunotinción células como control negativo. Posteriormente, las células se fijaron en 1% de paraformaldehído por 5 minutos en la oscuridad, se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se resuspendieron en 200 uL de tampón de PBS para ser analizada por citometría de flujo (FACSCalibur; BD Biosciences)
Preparación de países en desarrollo derivados de la médula ósea
Bone DC derivadas de médula se generaron a partir de 4 a 6 semanas de edad C57BL /6 ratones machos. DCs se cultivaron como se describe anteriormente [20] con algunas modificaciones. DCs se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS (Atlanta Biosciences), con 10 ng /ml de cada uno de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos recombinante (GM-CSF) y la interleucina-4 (IL-4) a partir de PeproTech Inc. (rock Hill, NJ). En el día 3 de cultivo, se añadió medio fresco a los cultivos de DC. En el día 6 de cultivo, las CD se expusieron durante 4 horas a la CD40-reorientado
Ad5-huPSMA
a MOI 100. Posteriormente, los países en desarrollo fueron madurados por incubación con 100 ng /ml de lipopolisacárido (LPS, Sigma, St Louis, MO) durante la noche. Los países en desarrollo madurado se lavaron dos veces con PBS y se administró por vía intraperitoneal (ip) en ratones C57BL /6.
Respuesta inmune tras la vacunación utilizando las DC estimulada
ex vivo con Ad5-huPSMA
Los ratones fueron vacunados con DCs infectadas-Ad (1 × 10
6 células /ratón) en suspensión en PBS estéril en un volumen total de 50 l por ip inyección en el día 0 y 14. El día 24, los ratones fueron sacrificados y se recogieron los bazos. suspensiones de células individuales se prepararon mediante el picado de los bazos en medio RPMI sin suero con unas tijeras y una dosificación repetida suave, seguido por su pase a través de las suspensiones de malla 100 mM de nylon. Las células rojas de la sangre se lisaron con tampón de lisis, y de las células T purificadas se lavaron dos veces en medio libre de suero, se contaron y se sembraron a una densidad de 1 × 10
6 células por pocillo de placas de 24 pocillos en 500 l de medio libre de suero.
Respuesta inmune tras la vacunación directa
in vivo
con Ad5-huPSMA
C57BL /6 ratones se inmunizaron mediante IP directa inyecciones con
Ad5-huPSMA
. Cada ratón se inyectó con 1 × 10
9 ifu de
Ad5-huPSMA
solo o 1 × 10
9 ifu de
Ad5-huPSMA
ha complejos con 1.200 ng de CFm40L en día 0. Una segunda dosis se administró 14 días más tarde. A los 24 días después de la inmunización inicial, los ratones fueron sacrificados y se recogieron los bazos y las células T se cultivaron como se ha descrito anteriormente.
Generación de CTL y la realización de pruebas de citotoxicidad
cultivadas células T de la bazos de ratón fueron re-estimularon durante 6 días con la adición de las células HEK-293 irradiados infectados con
Ad5-huPSMA
a más de expresar el antígeno PSMA. Después de volver a la estimulación, se recogieron las células T y se separan de las células muertas. La citotoxicidad se determinó en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 h usando las células T estimuladas como células efectoras (E) y RM-1 líneas celulares como objetivos específicos (t) en el E indicada: T ratios. Las líneas de células RM-1 (RM-1-PSMA clon 1, RM-1-PSMA clon 3, y clon RM-1-GFP 2) se utilizaron directamente como células diana o se incubaron previamente durante 24 h con
Ad5 -IFNγ gratis (MOI 100). Las células se marcaron con 100 Ci de Na
2
51CrO
4 durante 1,5 horas a 37 ° C. Posteriormente, 1 × 10
3 células diana marcadas se co-cultivaron con diferentes números de células efectoras en un 96 pocillos (placas de fondo en V) durante 4 horas a 37 ° C. Al final del cultivo, se recogieron 100 l de los sobrenadantes y se midió la radiactividad en un contador gamma. La liberación máxima y espontánea de
51Cr se obtuvo de los sobrenadantes de las células diana en 1% Nonidet P-40 y en medio solo, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron con pozos por cuadruplicado. La
51Cr de liberación se midió mediante un contador gamma (LKB Instruments, Gaithersburg, MD), y el porcentaje de lisis específica se calculó mediante la siguiente fórmula:
% de lisis específica = [(experimental cpm - cpm espontánea) /(cpm máxima - cpm espontánea)]
×
100
Flujo Análisis de citometría de NKG2D ligando Expresión
RM-1-PSMA. clon 3 células y células YAC-1 se sembraron a 100.000 células /pocillo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se dejó que las células se unieran por incubación durante la noche a 37 ° C. Al día siguiente, las células se incubaron en ausencia o presencia de
Ad5-IFN
en 100:1 MOI a 37 ° C en medio libre de suero. A las 2 h después de la infección, los medios de comunicación que contiene el virus se reemplazó con medio de crecimiento completo que contiene 10% de FBS. Después de 48 h, la no tratada o se cosecharon y se lavaron las células
Ad5-IFN
trató dos veces con PBS. Las células se incubaron durante 1 hora a 4 ° C con ficoeritrina (PE) de rata marcado IgG
anticuerpo de control de isotipo 2A (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) o con los siguientes anticuerpos: (a) un PE anticuerpo anti rata -mouse H60 anticuerpo monoclonal (R & amp; D Systems), de rata (b) un PE anti-ratón marcada Rae-1 (pan-específico) anticuerpo monoclonal (amp I +; D Systems) de rata, o (c) un PE anti-ratón marcada 1 MULT-anticuerpo monoclonal (R & amp; D Systems). Después de la incubación de anticuerpos, las células se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 0,4 ml de PBS, y se analizaron por citometría de flujo utilizando un instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).
viabilidad celular Ensayo
RM-1 en las células y RM-1-PSMA clon 3 se sembraron en placas de 96 pocillos (2.000 células /pocillo) con DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Después de una incubación durante la noche, las células se infectaron con
Ad5-IFN
a aumentar MOI (0, 0,1, 1, 10, 100, 1000 IFU /célula) en medio libre de suero a 37 ° C. El
Ad5-IFN
medio que contiene fue aspirado después de 2 horas y se sustituye por medio de cultivo completo. Un ensayo de viabilidad celular se realizó en los días 1, 2, 3, y 4 después de la infección usando el reactivo CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, en cada punto de tiempo, se añadió 20 l de reactivo CellTiter-Blue a los pocillos y se mezcló durante 10 segundos en un agitador. Las células se incubaron entonces durante otras 22 h a 37 ° C. Después, la señal de fluorescencia en cada pocillo se analizó usando un fluorómetro Fluoroskan Ascenso de microplacas (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA) con un ajuste de la excitación a 530 nm y un entorno de emisión a 620 nm.
esplénica efector aislamiento de células
control (sin tratar) de sexo masculino ratones C57 /BL6 fueron sacrificados por CO
2 asfixia. Los bazos se recogieron y se homogeneizaron manualmente entre los extremos del portaobjetos de vidrio esmerilado y se pasan a través de una 70-μ malla. células esplénicas dispersas se centrifugaron a 1000 rpm en una centrífuga de mesa durante 5 min y se resuspendieron en glóbulos rojos (RBC) de tampón de lisis (NH 138 mM
4Cl, mM de KHCO 1
3, y EDTA 0,1 mM) durante 5 min. Los esplenocitos restantes se lavaron tres veces en PBS enfriado con hielo. Las suspensiones celulares se contaron y se ajustaron a 1 x 10
7 células /ml
Ensayo de liberación de cromo
Para medir la sensibilidad de las células RM-1 de ratón NK lisis celular, una liberación de cromo. se llevó a cabo el ensayo. Inicialmente, las células RM-1 o el clon 3 células RM-1-PSMA se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 100 mm. Se dejó que las células se unieran por incubación durante la noche a 37 ° C. Al día siguiente, las células se incubaron en ausencia o presencia de
Ad5-IFN
en 100:1 MOI a 37 ° C en medio libre de suero. A las 2 h después de la infección, los medios de comunicación que contiene el virus se reemplazó con medio de crecimiento completo que contiene 10% de FBS. Después de 48 h, los no tratados o células
Ad5-IFN
tratadas se recogieron por tripsinización y se marcaron con
51 Cr. Las células diana se contaron y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10
7 células /ml de medio. A cada suspensión de células, 125 Ci de
51Cr se añadió (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) como una solución acuosa de cromato de sodio y se incubó durante 90 minutos a 37 ° C con agitación cada 15 minutos. Las células diana marcadas se lavaron una vez en PBS y tres veces en medio completo. Para iniciar el ensayo de liberación de cromo, se añadieron las células efectoras de esplenocitos aislados a los pocillos de placas de fondo en U de 96 pocillos (100, 50, 25, y 12,5 l para cada objetivo de células) en repeticiones de cuatro. Todos los pocillos se llevaron a un volumen final de 100 l con medio completo. Dos conjuntos de controles se emplearon en lugar de células efectoras: un juego sólo contenía 100 L de medio completo para dar cuenta de
liberación espontánea de 51Cr y un conjunto contenían 100 l de HCl 2N para dar cuenta de máxima
liberación de 51Cr. Las células diana marcadas se ajustaron a 1 x 10
5 células /ml, y 100 l se añadió rápidamente a cada uno de los pocillos de la placa. Las placas se incubaron a continuación a 37 ° C durante 4 horas. Después de la incubación, las placas se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. Una porción (100 l) del sobrenadante resultante se retiró a tubos de vidrio para el análisis usando un contador gamma, y el porcentaje de lisis específica se calculó mediante la siguiente fórmula:
% de lisis específica = [(experimental cpm - cpm espontánea) /(cpm máxima - cpm espontánea).] × 100
tumor Desafío Experimento
Los grupos de quince ratones C57BL /6 fueron inmunizados por IP directa inyección con
Ad5-huPSMA
. Cada ratón se inyectó con 1 × 10
9 ifu de
Ad5-huPSMA
solo o 1 × 10
9 ifu de
Ad5-huPSMA
ha complejos con 1.200 ng de CFm40L en día 0. Una segunda dosis se administró 14 días más tarde. La línea de células RM-1 de los padres o el clon 1 línea de células RM-1-PSMA se recogieron de los matraces de cultivo celular utilizando 1% de tripsina y se lavaron con PBS. Posteriormente, se inyectaron las células en los ratones C57BL /6 inmunizados como se describe anteriormente. Cada ratón recibió 4 × 10
5 células inyectadas en el día 24 después de la iniciación del régimen de inmunización. Posteriormente, el volumen del tumor se midió con un calibre digital (VWR International, Wayne, PA) cada cuatro días. En cada medición del tumor, se estimaron los mayores diámetros longitudinales (longitud) y los mayores diámetros transversales (anchura) se midieron, y los volúmenes de los tumores utilizando la fórmula:
volumen del tumor = ½ ×
(
longitud
×
ancho
2).
Análisis estadístico
los datos se presentan como media ± error estándar (SEM) de los puntos de datos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, usando el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc .; La Jolla, CA). Los datos se consideraron estadísticamente significativas cuando P. & Lt; 0,05
Resultados
Líneas Celulares
RM-1 Mouse Cáncer de próstata que expresan PSMA humano
La secuencia de ADNc de PSMA humano de longitud completa se clonó en expresión de mamífero plásmido vector pEF1 /V5-His aguas abajo de los elementos de potenciador /promotor del factor de elongación 1α subunidad humano (HEF-1α) para la expresión de alto nivel en células de mamífero. Como control negativo, la proteína verde fluorescente (GFP) cDNA fue también clonado en el vector V5-His pEF1 /expresión. La línea celular de cáncer de próstata de ratón RM-1 se transfectó con los vectores de expresión, y los clones individuales se aislaron por selección G418 seguido por dilución limitante.