Extracto
Oseltamivir fosfato es un inhibidor de sialidasa anti-influenza ampliamente utilizado. Sialilación, gobernada por sialiltransferasas y sialidasas, está fuertemente implicado en la oncogénesis y la progresión del cáncer de mama. En este estudio se evaluó el comportamiento biológico de las células tumorales mamarias caninas tras el tratamiento con oseltamivir fosfato (un inhibidor de sialidasa)
in vitro
y
in vivo
. Nuestros
in vitro
resultados mostraron que el fosfato de oseltamivir menoscabo de la actividad sialidasa lo que aumenta la sialilación en células de cáncer de mama canino CMA07 y CMT-U27. Sorprendentemente, fosfato de oseltamivir estimulada, CMT-U27 la migración celular y la capacidad de invasión
in vitro
, de una manera dependiente de la dosis. CMT-U27 xenoinjertos de tumores de ratones desnudos tratados con oseltamivir fosfato mostró una mayor sialilación, a saber α2,6 estructuras terminales y SLE (x) la expresión. Sorprendentemente, se observó una tendencia hacia el aumento de metástasis pulmonares en ratones desnudos tratados con fosfato de oseltamivir. Tomados en conjunto, nuestros resultados revelaron que el oseltamivir menoscabo de la actividad sialidasa de células de cáncer de mama canino, alteración del patrón de sialilación de tumores mamarios caninos, y que conduce, sorprendentemente, a
e in vitro
in vivo
aumentó mamaria la agresividad del tumor
Visto:. de Oliveira JT, Santos aL, Gomes C, R Barros, Ribeiro C, Mendes N, et al. (2015) La agresividad de la célula anti-influenza Inhibidor de la neuraminidasa oseltamivir fosfato Induce canina cáncer mamario. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10.1371 /journal.pone.0121590
Editor Académico: David Wai Chan, la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 de septiembre de 2014; Aceptado: 13 Febrero 2015; Publicado: 7 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 de Oliveira et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su apoyo a los archivos de información
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la agencia portuguesa "Fundação para a Ciência ea Tecnologia, Programa Operacional Ciencia e Inovação 2010 (POCI 2010) Quadro hacer Comunitário de Apoio III "y el Proyecto subvención no. PTDC /CVT /117610/2010. RB (SFRH /TLP /68276/2010) y CG (SFRH /TLP /96510/2013) reconocer la Fundación para la Ciencia y la Tecnología. Instituto de Patología Molecular e Inmunología es un Laboratorio Asociado del Ministerio de Ministerio de Ciencia, Tecnología y Educación Superior portugués y es parcialmente apoyado por la Fundación para la Ciencia y la Tecnología
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer sigue siendo una gran carga social y económica en el mundo occidental. De hecho, a pesar de todos los esfuerzos para reducir tal aflicción, el número de pacientes ha ido aumentando de manera exponencial en los últimos años. El cáncer de mama en particular, es el cáncer más común en las mujeres y la causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer, sobre todo debido al desarrollo de metástasis a distancia [1].
Los mecanismos implicados en el establecimiento de colonias en cáncer órganos distantes es lejos de ser entendido, como son las razones reales que conducen a la muerte relacionada con la metástasis. Por lo tanto, identificar e investigar fármacos utilizados actualmente clínicamente que podrían tener un impacto en la progresión tumoral es obligatoria [2]. Por ejemplo, al interferir con numerosas vías de células que son comunes o similares entre patógenos y huéspedes, fármacos tales como la rapamicina y la niclosamida (que se utilizaron inicialmente como antifúngicos y antihelmínticos drogas respectivamente) han resultado ser agentes anticancerígenos prometedores [3, 4] .
fosfato de oseltamivir es un medicamento contra la influenza que se ha usado ampliamente como tratamiento profiláctico desde los tiempos de las pandemias de gripe H1N1 [5]. Se administra como el fosfato de oseltamivir profármaco, que es convertido por enzimas carboxilo esterasa en el carboxilato de oseltamivir activo. fosfato de oseltamivir es un análogo del ácido siálico que interactúa con y bloquea los sitios activos de enzimas sialidasa del virus de la gripe, se une a las enzimas de virus, el bloqueo de su capacidad para escindir residuos de ácido siálico en la superficie de la célula infectada que resulta en una incapacidad para liberar los viriones progenie [6].
Algunas sugerencias se han hecho con anterioridad en relación con los efectos farmacológicos potencialmente relevantes de este y otros inhibidores de sialidasas virales utilizados en las clínicas, en sialidasas endógenos humanos [7]. Aunque bajas concentraciones nanomolares de carboxilato de oseltamivir son suficientes para bloquear la actividad de las sialidasas virales, este fármaco ha demostrado casi ninguna inhibición apreciable de sialidasas humanos [7, 8]. Sin embargo, se obtuvieron resultados contradictorios cuando el fosfato de oseltamivir se puso a prueba en las células cancerosas usando ambos
in vitro
y
in vivo y modelos [9, 10]. De hecho, algunas observaciones indicaron un posible efecto inhibidor de fosfato de oseltamivir en sialidasas endógenos de ratas y ratones [11-14]. Más recientemente, se ha sugerido que el fosfato de oseltamivir tenía la capacidad de revertir el epitelio mesenquimal proceso de transición (EMT) y aumentar la sensibilidad al fármaco de las células cancerosas humanas chemoresistant [10].
Glicanos
Sialylated están asociados epidemiológicamente con un peor pronóstico en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama [15]. Los ácidos siálicos son monosacáridos ácidos que normalmente se encuentran en la posición terminal de cadenas de carbohidratos presentes en las glicoproteínas y glicolípidos [16]. A través de interacciones complejas con selectinas y Siglecs entre otras moléculas, ácidos siálicos son fisiológicamente presente en diferentes tipos de interacciones célula-célula. Los ácidos siálicos aumentar la fuerza de densidad de carga en toda la cadena de glicano, debido a la presencia de su resto de ácido carboxílico, asociando a los cambios en las propiedades de adhesión glicanos '[17]. Los ácidos siálicos se transfieren desde un sustrato donante a una estructura de glicano presentes en un glicoconjugado propuesta por sialiltransferasas [18, 19]. Por otro lado, su eliminación de las cadenas de glicano es catalizada por sialidasas. La actividad de estas enzimas se cree que afecta la conformación de las glicoproteínas, y por lo tanto contribuir a ya sea un mayor reconocimiento o el enmascaramiento de los sitios biológicamente relevantes en las moléculas y las células [20].
El aumento de grupo sanguíneo sialilado de tipo Lewis antígenos tales como sialil Lewis X (LES (x)) y pequeñas glicanos truncadas tales como sialil Tn (STn) se encuentran entre las alteraciones de glicano más comunes en células del cáncer [21-24]. Varios ensayos funcionales en los que Sialylated glicanos se muestran a desempeñar un papel en el aumento de la migración y la invasión ambos
in vitro
y
in vivo
se encuentran en la literatura [19, 24]. Por otro lado, la manipulación de sialilación
in vitro
También se ha mostrado t veces reducen la capacidad invasiva de las células del cáncer [25]. Como resultado, la modulación de glicanos sialilados se ha defendido como un objetivo putativo para la terapia neo-adyuvante en el cáncer [26]. Sin embargo, debido a la amplia gama y la complejidad de sialiltransferasas y todas las otras glicosiltransferasas implicadas en el proceso de sialilación, hay dificultades con convertir ácidos siálicos en objetivos terapéuticos clínicamente relevantes [27, 28] bien reconocido. Sin embargo, a pesar de que hay más de 20 diferentes sialiltransferasas conocidos, sólo hay cuatro identificados y caracterizados sialidasas de mamíferos [20]. Curiosamente, los cuatro sialidasas de mamíferos conocidas son homólogas a las de los virus que contienen, en algunos casos, los residuos idénticos a los encontrados en el sitio enzimático activo [29].
Hay así una necesidad apremiante de estudiar contextos neoplásicas en que fosfato de oseltamivir podría inhibir competitivamente sialidasas de mamífero [30]. Diferentes resultados es probable que surjan y pueden depender de la diana de la inhibición del presente y del conjunto de glicoconjugados afectados [20]. En este trabajo se han estudiado los efectos de la inhibición de la sialidasa como un modulador de los mecanismos relacionados con la sialilación-de invasión de los tumores de células mamarias utilizando tanto
e in vitro
in vivo
enfoques.
material y Métodos
líneas celulares y condiciones de cultivo
con el fin de evaluar las posibles diferencias de tratamiento de fosfato de oseltamivir en líneas de células benignas y malignas, se utilizaron dos líneas de células mamarias en este estudio: uno línea celular de adenoma derivados (CMA07-estableció en nuestro laboratorio a partir de un adenoma complejo canino espontáneo extirpado de un perro hembra 6 años de edad, con fines curativos con los propietarios de consentimiento [31]) y una línea celular de carcinoma de derivados (CMT-U27 - línea celular de carcinoma canina altamente metastásico, proporcionado amablemente por el profesor Eva Hellmen, de Suecia [32]). Las dos líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora (Thermo Scientific) y se mantuvieron en medio RPMI 1640 con Glutamax y Hepes 25 mM (Gibco Life Technologies), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco Life Technologies) y 1% de penicilina estreptomicina (P /S) (Gibco Life Technologies).
actividad de sialidasa ensayo
Superior se espera que los niveles de sialilación en las células malignas en comparación con homólogos benigna. Esto es lo más probable que sea dependiente de la actividad tanto en sialyltranferases y sialidasa [17]. Para evaluar el efecto del fosfato de oseltamivir sobre la actividad de las sialidasas, un
in vitro
ensayo usando un ácido siálico modificado (4-metil-umbeliferil-Nacetylneuraminic ácido-4-Munana), se ha realizado mediante CMA07 y CMT- las células tumorales mamarias caninas U27. actividad de la sialidasa se determinó mediante la obtención de la conversión metabólica del análogo de ácido siálico, 4-Munana, en el compuesto metil-umbeliferona fluorescente (color azul), tras el tratamiento con diferentes dosis de fosfato de oseltamivir. Las células fueron cultivadas en 12 mm de vidrio circular hasta confluencia y después se incubaron durante 24 h con medio que contenía diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir (0,305 M, 3,05 M, 30,5 micras y 305 de fosfato M oseltamivir disuelto en PBS), y el vehículo del fármaco (PBS ) se utilizó como control. Después de 24 horas de tratamiento, cada vaso circular de 12 mm se colocó en un portaobjetos y se incubó en un 2 micras 4-Munana (2 '- (4-Methylumbelliferyl) ácido -α-DN-acetilneuramínico) (Sigma, Saint Louis, EE.UU.) solución . Los portaobjetos se observaron inmediatamente con microscopía de epi-fluorescencia bajo luz UV (longitud de onda de excitación a 360 nm, y la emisión de longitud de onda a 440 nm), como se ha descrito anteriormente [33]. Las láminas fueron analizados y las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy).
análisis de la morfología de la célula
p>
4 células por pocillo en placas de 6 pocillos, por triplicado. Se estudiaron tres concentraciones de fosfato de oseltamivir diferentes: 0,305 M, 3,05 M y 30,5 mM, y PBS se utilizó como control. Análisis de la confluencia celular y la morfología se realizó con un microscopio invertido de contraste durante un período de 7 días. Las fotografías fueron tomadas en los días 0 y 7 bajo magnificación de 200x
La proliferación celular ensayo
p>
4. Este ensayo se repitió 3 veces y se trazaron las curvas de crecimiento.
El crecimiento celular ensayo
El crecimiento celular se determinó en líneas celulares CMA07 y CMT-U27 utilizando un kit disponible comercialmente CellTiter 96 acuoso reactivo One Solution (Promega Corporation), y realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado (naranja Scientific), a una densidad de 5x10
3 células por pocillo. Después de la unión celular, se añadió fosfato de oseltamivir en 0,305 M, 3,05 M, 30,5 mM y 305 mM y concentraciones finales PBS se utilizó como control. El metabolismo celular se midió mediante la adición de reactivo de tetrazolio MTS y la absorbancia se registró a 490 nm. Las mediciones se realizaron a 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 y 48 horas. Una medida de control adicional se llevó a cabo en el momento de punto 0h, en un pocillo de cultivo sin células. Los experimentos se llevaron a cabo dos veces.
ensayo de TUNEL
líneas celulares
CMA07 y CMT-U27 se cultivaron en placas de 6 pocillos y después se trataron con diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir (0,305 M, 3,05 M, 30,5 mM y 305 mM, y PBS se utilizó como control). Después de 24 horas de tratamiento, el medio de cultivo y las células se recogieron tripsinizan y se centrifugó durante 10 minutos a 2000 rpm. Las células se lavaron en PBS y se fijaron en metanol frío durante 20 minutos. Después de la fijación, las células se ressuspended en 1 ml de PBS para realizar el procedimiento citospina. Brevemente, 100 l de suspensión de células se centrifugaron en una centrífuga cytospin3 usando portaobjetos recubiertos polilisina. Los portaobjetos se usaron entonces para
in situ
detección de muerte celular usando un kit comercialmente disponible (
In situ
kit de detección de muerte celular, fluoresceína de Roche) basado en ADN etiquetado doble filamento se rompe (tecnología TUNEL) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se observaron con un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de 488 nm de excitación y el porcentaje de células muertas se calculó mediante el registro de células TUNEL positivas en relación con el total de células utilizando el software ImageJ. Este ensayo se realizó dos veces.
Wound-curación
El ensayo de cicatrización de heridas se realizó con un benigna (CMA07) y un altamente metastásico (CMT-U27) línea celular de tumor mamario canino en una microscopio de lapso de tiempo. Brevemente, se sembraron 20x10
4 células en una placa de cultivo de 24 pocillos y después de alcanzar alta confluencia de una "herida" artificial se hizo con una punta de pipeta. El medio de cultivo fue reemplazado con las diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir: 0,305 M, 3,05 M y 30,5 mM de fosfato de oseltamivir y PBS como control. la adquisición de imágenes de la herida se realiza con intervalos de 5 minutos durante 48 horas, utilizando el programa de Axio Vision Release 4.8.2. y convertido en video. El tratamiento de células con 305 mM de fosfato de oseltamivir no se realizó debido a su citotoxicidad anteriormente mostrado. Este ensayo se realizó dos veces.
Matrigel Invasion Ensayo
Un ensayo de invasión de Matrigel se realizó para evaluar la capacidad invasiva de las células de CMT-U27, un buen modelo para estudiar la invasión de células [34]. Los insertos de Matrigel fueron re-hidratados con RPMI 1640 durante 1 hora a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO2 (Thermo Scientific). Las condiciones de los medios de comunicación fueron los mismos en los pozos de la parte superior e inferior (RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina y streptimicin).
Después de la rehidratación de inserción, 1x10
se sembraron 5 células en cámaras de Matrigel recubierto en presencia de diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir (0,305 m, 3,05 m, 30,5 mM de fosfato de oseltamivir) y PBS como control, y se mantuvieron en cultivo durante 6 horas más (punto de tiempo previamente optimizada para ensayos de invasión utilizando esta línea celular ). El fármaco se utiliza en los pocillos superiores. Después de la incubación, se retiró el contenido de cada inserto y se lava dos veces con PBS para eliminar las células no invasor. células invasivas se fijaron con metanol frío durante 20 minutos, las inserciones se transfirieron a portaobjetos (Calidad Industrial) y se montaron con Vectashield medio con DAPI (Vector Laboratories) de montaje. células invasoras se registraron mediante el recuento del número de células presentes en el inserto. Estos experimentos se realizaron 3 veces.
Fluorescent citoquímica
Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y el medio de cultivo se suplementó con 0,305 M, 3,05 M y 30,5 fosfato de oseltamivir mu M y PBS como control, para 24 horas. Después, las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol frío durante 20 minutos. Después de la fijación, las células se re-hidratados con PBS y se bloquearon con 10% de BSA durante 20 minutos. Planta lectinas SNA (biotinilado saúco lectina de corteza, B-1305, Vector Laboratories), LMA I (biotinilado Maackia amurensis lectina I, B-1315, Vector Laboratories), y MAL II (biotinilado Maackia amurensis lectina II, B-1265, Vector Laboratories ) se diluyeron 1: 300 en 5% de BSA en PBS y se incubaron en portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. a continuación, se lavaron los portaobjetos tres veces con PBS y se incubó 1 hora con estreptavidina-FITC. Después de dos lavados con PBS, los portaobjetos se incubaron durante 10 minutos con DAPI (Sigma-Aldrich) en PBS y portaobjetos se montaron en Vectashield medio (Vector Laboratories) para el análisis de fluorescencia de montaje. Las láminas fueron analizados y las imágenes fueron tomadas en un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy).
El análisis de Western Blot
Las células de CMA07 y líneas de células CMT-U27 se cultivaron hasta la confluencia en 6 pocillos -placas y diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir se añadieron al medio (0,305 M, 3,05 M y 30,5 mM de fosfato de oseltamivir). Después de 24 horas de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se lisaron usando tampón de lisis RIPA (50 mM Tris HCl, pH 8; NaCl 150 mM; 1% NP-40; 0,5% desoxicolate de sodio; 0,1% SDS ) que contiene completa cóctel inhibidor de la proteasa (Roche), 1 mM de PMSF (fenilmetil sulfonil fluoruro) y 1 mM Na
3Vo
4 (ortovanadato de sodio). La concentración de proteína se determinó utilizando el método del ácido biocinchoninic de Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los extractos de proteína total se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences /GE Healthcare Life Sciences) y se incubaron con diferentes biotinylatedlectins: LMA I (B-1315, vector Laboratories), LMA II (B-1265, vector Laboratories) y SNA (B-1305, vector Laboratories) diluido 1 : 500 en 5% de BSA (Sigma-Aldrich) en PBS con 0,05% de Tween-20 (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Después de lavar con PBS 0,05% de Tween-20, las membranas fueron incubadas con avidina-biotina-peroxidasa kit complejo (kit Vectastain ABC Standard, Vector Laboratories) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el LES (x) y el análisis STn, las membranas se incubaron con anticuerpos monoclonales de ratón, km93 (Millipore) diluido 1: 500 y TKH2 (suavemente ofrecido por el Dr. H. Clausen de Dinamarca), seguido de incubación con un anti-ratón conjugado con HRP anticuerpo secundario durante 1 hora. El análisis se realizó por quimioluminiscencia utilizando el reactivo y las películas de detección ECL Western Blot (ambos de GE Healthcare). Western blot para la actina diluyó 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como control de carga
electroforesis en gel
2D
Las diferencias en las proteínas individuales son difíciles de visualizar usando análisis estándar Western Blot.. Tratando de superar esto, hemos realizado un análisis de geles 2D que mejor discrimina glicoformas de proteínas en los extractos de proteínas. Las muestras de proteína de CMA07 y células CMT-U27 tratadas con 3,05 M de oseltamivor y control de las células tratadas con PBS se precipitaron (ProteoExtract, Calbiochem) y se resuspendieron en tampón de rehidratación (urea 7 M, 2 M de tiourea, 4% (V) CHAPS v /y 0,0002 % azul de bromofenol) con 0,2% de anfolito y cuantificados (2D Quant Kit de GE Healthcare). rehidratación pasiva de las tiras se realizó durante la noche con 200μg de proteínas totales utilizando tiras de IPG de pH 3 a 10 NL (ReadyStrip; 0,5 mm x3 x70, Bio-Rad, Hercules) a temperatura ambiente. El enfoque isoeléctrico se realizó en células Protean IEF (Bio-Rad) con una tensión inicial de 250 V durante 15 min, y luego mediante la aplicación de un gradiente de voltaje hasta 4000 V con una corriente de 50 mu por tira y temperatura se ajustó a 20 ° C limitante. La primera dimensión se concluyó en 14 a 20 kVh.
Siguiendo el enfoque isoeléctrico proteínas se redujo y se alquiló mediante incubación con 2% DL-ditiotreitol (DTT), seguido de 2,5% yodoacetamida en un tampón de equilibrio (urea 6M, 2% de SDS, 0,002% azul de bromofenol, 75 mM Tris pH 8,8, 29,3% de glicerol) durante 10 min cada uno bajo agitación suave. Las tiras fueron entonces lleno en la mínima gelificación 1% (1% de agarosa en el funcionamiento de buffer-25 mM Tris, glicina 192 mM, y 0,1% (w /v) SDS, pH 8,3; Bio-Rad) en la parte superior de un 10% gel de acrilamida (acrilamida /bisacrilamida 37,5: 1, 2,6% de Bio-Rad). electroforesis segunda dimensión se realizó en un sistema de células de tetra Mini-Protean (Bio-Rad) utilizando tampón 1xTris /glicina /SDS a voltaje constante de 125 V. El análisis de transferencia de Western usando SNA lectina se realizó como se describe en la sección anterior.
los estudios en animales
los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio, la Directiva 2010/63 /UE y el Reglamento Nacional publicados en 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). N: ratones desnudos NIH (S) II-nu /nu, fueron alojados, breeded y se mantuvieron a la Animal House IPATIMUP, en un entorno libre de patógenos en condiciones controladas de luz y la humedad. Se establecieron los siguientes puntos finales: cualquier señal de angustia, sufrimiento o dolor, pérdida de peso corporal mayor que el 20-25% de la masa corporal, la anorexia y estado moribundo, relacionada o no con el procedimiento experimental
Experimental. grupos de ratones y de tratamiento de drogas
Mujer NIH (S) II-nu /nu ratones desnudos, de 4-6 semanas, se inocularon ortotópicamente con 1 x 106 células de cáncer de mama canino CMT-U27 viables en la almohadilla de grasa mamaria usando una aguja de calibre 25. Se inocularon un total de 8 ratones. Cuando los nódulos alcanzaron un volumen de aproximadamente 500mm3, los ratones (n = 8) fueron aleatorizados y divididos en grupo control (n = 4) y grupo de tratamiento (n = 4) .Los animales recibieron por vía intraperitoneal (IP) o bien dailly 100 l de PBS ( grupo de control) o 100 mg /kg de fosfato de oseltamivir (Tamiflu de Roche) comprados en la farmacia, diluido en PBS (grupo de tratamiento) hasta el momento de la muerte. El tamaño del tumor se midió usando calibres, y el volumen del tumor (mm3) se estimó por anchura x longitud x altura. Para observar metastización, tumores primarios de todos los ratones se retiraron quirúrgicamente cuando se alcanzó un volumen medio de ~ 1000-1500mm3. Los ratones fueron anestesiados por administración IP de 100 l de una mezcla que contiene 50 mg /kg de ketamina (Imalgene 1000) y 1 mg /kg de clorhidrato de medetomidina (Medetor) y el tumor fue extirpado. Se utilizó 2,5 mg /kg de atipamezol (Revertor) por los ratones para antagonizar el efecto de la anestesia. Los ratones se trataron con una solución oral de 10 mg /kg de clorhidrato de tramadol (Tramal) cada 8h para 24-48h para prevenir el dolor. Los animales fueron seguidos después de la extirpación quirúrgica de los tumores primarios para la invasión y /o signos metastización
.
Todos los ratones fueron sacrificados de acuerdo a los puntos finales establecidos y necropsia. Los tejidos se fijaron en formalina al 10%, procesados e incluidos en parafina. Tres secciones micrométricas fueron cortadas y teñidas con hematoxilina & amp; eosina (HE) para su posterior análisis histopatológico e inmunohistoquímico. evaluación histopatológica de los tumores primarios y metástasis respectivas, así como la evaluación de la inflamación (contando el número de infiltrados inflamatorios presentes en todo el xenoinjerto) se llevó a cabo de forma independiente por dos patólogos.
histoquímica e inmunohistoquímica con lectinas
la expresión de las estructuras sialiladas en xenoinjertos CMT-U27 de ratones tratados con oseltamivir y controles se realizaron con plantas lectinas SNA, MAL MAL I y II.
Las láminas fueron deparaffinized y rehidratada seguido de la recuperación del antígeno con hirviendo 0,005% Extran durante 8 minutos. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con 10% de H2O2 en solución de metanol durante 10 minutos, y se desliza fueron bloqueadas con 10% de BSA en PBS (pH 7,4) durante 30 minutos.
A continuación, las secciones tumorales se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el biotinilado SNA, MAL I y II MAL (vector Laboratories.), diluido a 1: 250, 1: 250 y 1: 150, respectivamente, en 5% de BSA en PBS. a continuación, se lavaron los portaobjetos en PBS, se incubaron con la avidina-biotina-peroxidasa (ABC) durante 30 minutos y se desarrolló con sustrato diaminobenzidina tetrahydroxychloride, DAB (SIGMA FAST). Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con los anticuerpos primarios anti-Ki67 anticuerpo monoclonal (clon MIB1, Dako), anti-caspasa-3 (clon 5A1E, Señalización Celular), y anti-LES (x) (km93, Millipore ) a 1:50, 1: 100 y 1: 200, respectivamente, en 5% de BSA en PBS. a continuación, se lavaron los portaobjetos en PBS, se incubaron con el sistema de Novolink Max Polymer detección (1250 testículos), Novocastra, (Newcastle, Reino Unido) durante 30 minutos a temperatura ambiente y desarrollado la aplicación de DAB de la misma kit durante 5 minutos.
las diapositivas fueron de contraste con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron con Histomount (National Diagnostics). Los controles negativos, sin lectinas o anticuerpos, se incluyeron. Todas las secciones teñidas se examinaron con microscopía de luz y revisados por tres observadores (de Oliveira J .; Ribeiro, C .; y Gartner, F.).
El análisis estadístico
Cuando proceda, los resultados se presentan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA de un factor (análisis de varianza) de prueba. Para MTS, la proliferación celular, y el crecimiento celular ensayos de comparaciones múltiples se utiliza el método de Dunnett. Se llevó a cabo la t de Student para evaluar la cicatrización de la herida los resultados del ensayo. comparaciones múltiples se utilizó la prueba de Tukey para estudiar ensayo de invasión de matrigel celular y comparaciones múltiples de Bonferroni se utilizó para el análisis de ensayo de TUNEL. GraphPad Prism versión 5.02 se utilizó para llevar a cabo estos análisis estadístico.
imágenes inmunohistoquímico de Ki-67 y la caspasa-3 de expresión se analizaron mediante las herramientas de análisis en línea ImmunoRatio, bajo la magnificación de alta potencia en cada área [35] . casos de tumores se dividieron en 3 categorías de acuerdo con la puntuación de Ki67: células de menos de 10% Ki67 positivas (baja), 10 a 50% de células Ki67 positivas (moderado) y células de más de 50% Ki67 positivas (alto). Para evaluar la caspasa 3 y LES
x expresión, los tumores se agruparon según el porcentaje de células inmunorreactivas a lo largo de toda la lesión, en 3 clases: 0% (negativo); menos de 5% (células raras) o 6-10% (bajo). En cuanto a SNA y la expresión MAA I, un análisis semi-cuantitativo en el que las muestras se obtuvieron de acuerdo con el porcentaje de células positivas. Los tumores se agrupan en: menos de 25% (bajo); 25 a 50% (moderada) y más de 50% (alto). Entonces se pusieron a prueba las hipótesis de asociación, mediante la prueba de Chi-cuadrado para las variables discretas. Se utilizó el software SPSS (versión 22.0) para el análisis estadístico.
Resultados
Influencia de la absorción de fosfato de oseltamivir por las células CMA07 y CMT-U27 de la actividad sialidasa endógena de
in vitro
Oseltamivir tratamiento con fosfato de la actividad de alteración de sialidasa (hidrólisis ácido neuramínico), como se muestra por una disminución de la fluorescencia metil-umbeliferona en ambas líneas celulares (Fig 1). Además, una disminución de la actividad sialidasa era cada vez más evidente en las concentraciones de fosfato de oseltamivir superiores.
células CMA07 y CMT-U27 se trataron durante 24 horas con diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir (0,305 m, 3,05 m, 30,5 mu M y 305 mM) o PBS como control, y se incubaron con una solución 2 M 4-Munana. Los portaobjetos se observaron inmediatamente con un microscopio de epi-fluorescencia con luz UV. Ambas líneas celulares mostraron disminución de la actividad sialidasa según la evaluación de los fluorescentes metil-umbeliferona, que resulta de la conversión metabólica de la 4-Muñana.
Efecto del tratamiento con fosfato de oseltamivir en CMA07 y células CMT-U27 morfología, viabilidad y la muerte celular programada
Para evaluar el efecto de diferentes dosis de fosfato de oseltamivir en la morfología celular, la viabilidad y la muerte celular programada, el
in vitro
ensayos se llevaron a cabo a continuación.
leves en la morfología celular en CMA07 células tratadas con fosfato de oseltamivir. No se observaron alteraciones importantes en la morfología celular CMT-U27 (Fig S1)
.
El análisis estadístico no mostró diferencias significativas en la tasa de crecimiento de ambos CMA07 (
p = 0,6209
) y CMT-U27 (
p = 0,9929
) líneas celulares, tras el tratamiento con fosfato de oseltamivir (figura 2A). A fin de evaluar el efecto del tratamiento oseltamivir en CMA07 y la viabilidad celular CMT-U27, el ensayo colorimétrico MTS, que determina la actividad metabólica celular, se realizó, durante 48 horas. La actividad metabólica de CMA07 y líneas de células CMT-U27 se redujo significativamente con el tratamiento con fosfato 305 mM oseltamivir (
p = 0,005
y p & lt; 0,0001, respectivamente) utilizando uno testículos vías ANOVA (análisis de varianza). Por el contrario, estadísticamente no se observaron alteraciones significativas con 0,305 M (p = 0,9781), 3,05 M (
p = 0,7436
) y 30,5 M (
p = 0,9623
) de los tratamientos de oseltamivir fosfato cuando en comparación con las células control (figura 2B). Por último, para evaluar el efecto del fosfato de oseltamivir en CMA07 y CMT-U27 la muerte celular programada, y dado que las células deteriorado tratamiento con fosfato de oseltamivir 305 mM actividad metabólica, una medición de la muerte celular programada se realizó con el ensayo TUNEL. el tratamiento con fosfato de oseltamivir de veinticuatro horas, específicamente a 305 mM, aumentó significativamente CMA07 (
p = 0,0010
) y CMT-U27 (
p = 0,0002
) la fragmentación del ADN, lo que sugiere la promoción de celular programada la muerte, en comparación con las concentraciones más bajas de oseltamivir, o con PBS (Fig 2C paneles superior e inferior).
el crecimiento celular evaluada con azul de tripano (A) o con el ensayo de MTS (B) y la muerte celular programada (C ) fueron evaluados en CMA07 y células CMT-U27 después del tratamiento con fosfato de oseltamivir (0,305 M, 3,05 M, 30,5 M y 305 M) o PBS como control. Las células (A) se cultivaron en presencia de diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir, y el crecimiento celular se monitorizó durante 7 días contando el número de células viables al día. No hay diferencias significativas en las tasas de crecimiento de las células tratadas fueron verificadas en comparación con células no tratadas, excepto por una disminución del crecimiento en las células CMA después de 4 días de tratamiento con fosfato de oseltamivir 305 mM. (B) Las células se cultivaron en presencia de las diferentes concentraciones de fosfato de oseltamivir, y la actividad metabólica celular se controló adicionalmente usando un ensayo de MTS, de una manera transcurso de tiempo durante 48 horas. células CMA07 y CMT-U27 tratadas con 305 mM de fosfato de oseltamivir mostraron una disminución significativa en su actividad metabólica (***
p
& lt; 0,001), pero no hay cambios se verificaron con las concentraciones más bajas. (C) CMA07 y CMT-U27 se trataron con diferentes concentraciones de oseltamivir durante 24 h. Las células tratadas con 305 mM de fosfato de oseltamivir también mostraron un aumento estadísticamente significativo en la muerte celular programada (*** p
y lt; 0,001) después de 24 horas de tratamiento con fosfato de oseltamivir pero sin alteraciones se verificaron con las concentraciones más bajas (gráficos