Extracto
El Bit1 mitocondrial (Bcl-2 inhibidor de la transcripción 1) la proteína es una parte de una vía apoptótica que se regula exclusivamente por la unión mediada por la integrina. Como un efector anoikis, Bit1 se libera en el citoplasma después de la pérdida de la unión celular e induce una forma independiente de caspasas de la apoptosis. Teniendo en cuenta que la resistencia a la anoikis es un determinante crítico de la transformación, la hipótesis de que las células cancerosas pueden eludir la vía apoptótica Bit1 para alcanzar anclaje independencia y potencial tumorigénico. Aquí, nos proporcionan la primera evidencia del efecto supresor del tumor de Bit 1 a través de un mecanismo que implica la inducción anoikis en las células A549 derivadas de adenocarcinoma de pulmón humano. Restitución de Bit 1 en las células A549 resistentes anoikis es suficiente para inducir la apoptosis inducida por el desprendimiento pesar defecto en la activación de caspasas e impide su crecimiento independiente de anclaje. Por el contrario, la regulación por disminución estable de Bit1 en estas células aumenta significativamente la resistencia sus anoikis y el crecimiento independiente de anclaje. Los desmontables células presentan una mayor BIT1 significativamente tumorigenecity
in vivo
. Se ha demostrado previamente que la corepressor TLE1 nuclear es un oncogen putativo en el cáncer de pulmón, y se muestra aquí que TLE1 bloques Bit 1 anoikis en parte mediada por el secuestro de la pareja pro-apoptótica de Bit 1, el potenciador amino-terminal de Split (AES) proteínas, en el núcleo. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren un papel supresor tumoral del efector anoikis caspasa-independiente Bit1 en el cáncer de pulmón. En consonancia con su papel como un supresor de tumores, hemos encontrado que Bit 1 es downregulated en el cáncer humano no microcítico de pulmón de células tejidos (NSCLC) guía
Visto:. Yao X, S Jennings, Irlanda SK, Pham T, templo B, Davis M, et al. (2014) La Anoikis Efector Bit 1 Muestra del tumor supresor función en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10.1371 /journal.pone.0101564
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Marzo, 2014; Aceptado: June 8, 2014; Publicado: 8 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Yao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel y presenta su información de apoyo
Financiación: Este trabajo fue apoyado por Louisiana Consorcio de Investigación del Cáncer (LCRC) Poner en marcha Grant (HB), NIH RCMI G12RR026250-03 Grant (de la Universidad Xavier de Losuiana), y los NIH 1R15CA158677-01A1 Grant (HB). Estos proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
un determinante crítico de un fenotipo epitelial maligno es la independencia de anclaje. La pérdida de dependencia de anclaje a la matriz extracelular por células malignas les permite crecer en ausencia de la adhesión celular, para propagar en una matriz tridimensional, para invadir los tejidos adyacentes, y metástasis en órganos distantes [1], [2]. Los mecanismos moleculares y rutas celulares subyacentes de anclaje a la independencia de las células cancerosas han sido ampliamente estudiados [3], y la mayoría de estas alteraciones moleculares confieren células malignas la capacidad de eludir el programa anoikis que está en su lugar en las células normales. Teniendo en cuenta que la ruptura del control anoikis contribuye al crecimiento y la malignidad de muchos tumores sólidos, la restauración de la sensibilidad anoikis representa una importante estrategia terapéutica en la reducción de la agresividad del tumor y la metástasis. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas moleculares de la vía de la muerte celular anoikis mediada tiene implicaciones terapéuticas significativas.
dos vías de apoptosis, el mitocondrial (intrínseca) y del receptor de muerte celular (extrínseca), se ha demostrado que regular la anoikis proceso. Tras la pérdida de desprendimiento inducido de la integrina señalización mediada por la supervivencia, la vía apoptótica intrínseca se activa a través de la activación de los miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl de proteínas (incluyendo Bax, Bad, Bid y Bim). Estas proteínas activan la permeabilización de la membrana mitocondrial externa que conduce a la liberación citosólica de citocromo c y la activación aguas abajo de las enzimas caspasas [5], [6]. Este bucle de activación de la caspasa mitocondrial dependiente, que puede amplificarse aún más a través de la regulación por disminución de la expresión de los miembros anti-apoptótica Bcl familia (como Bcl-2 y Bcl-XL) que funcionan en la vigilancia de la integridad mitocondrial [7], se podría provocar la la fragmentación del ADN y la muerte celular. La vía del receptor de muerte (extrínseca) depende de la unión de ligandos de muerte (FAS o TRAIL) a receptores de muerte y utiliza la formación de un inductor de la muerte complejo de señalización (DISC) en la activación de la caspasa-8 aguas abajo. Este mediada por receptores de muerte de la caspasa 8 de activación puede efectuar la desestabilización de la membrana mitocondrial que conduce a la apoptosis [8], [9]. A pesar de la convergencia y la diafonía entre las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos existen en los distintos niveles, ambas vías se basan en bucle de activación de caspasas para efectuar la muerte celular. Sin embargo, han surgido evidencias que indica la existencia de mecanismos de caspasa-independiente en anoikis [10],. En particular, la inhibición de la activación de caspasa o bien a través de la sobreexpresión de Bcl-2 o el tratamiento con inhibidores de caspasa globales es incapaz de bloquear anoikis basales en las células tumorales tal como se evaluó por análisis de escalera de ADN [10]. El modo de la caspasa-independiente alternativa de anoikis es una importante diana terapéutica en tumores que exhiben una vía de la apoptosis dependiente de caspasa discapacitados.
Ruoslahti y sus colegas han identificado recientemente una nueva vía apoptótica dependiente de integrina que está mediada por la mitocondrial Bit1 (Bcl2, inhibidor de la transcripción 1) la proteína [11]. Después de la pérdida de la unión celular mediada por la integrina, Bit1 se libera en el citoplasma, forma un complejo con el coregulator transcripcional AES, y posteriormente induce un modo de caspasa-independiente de la apoptosis. Mientras que varios factores anti-apoptóticos conocidos, tales como Bcl-2, Bcl-XL, Akt son ineficaces en el bloqueo de Bit1 apoptosis, la unión mediada por la integrina es el único tratamiento anti-apoptótica que puede suprimir Bit1 función apoptosis [11]. Teniendo en cuenta que la adhesión celular mediada por integrina, en particular la integrina α5β1, es el único tratamiento de aguas arriba que puede bloquear la vía de la apoptosis Bit 1, Bit 1 puede desempeñar un papel importante en la anoikis como un guardián de la dependencia de anclaje [11] - [15]. Sobre la base de la incapacidad de los inhibidores de caspasas para inhibir Bit1 apoptosis y la ausencia de activación de la caspasa en las células transfectadas Bit1, la vía Bit1 puede representar uno de los mecanismos anoikis independiente de caspasas en las células malignas [11]. Por lo tanto, la vía apoptótica Bit1 parece ser una diana terapéutica atractiva en eludir la resistencia anoikis particularmente en las células tumorales que presentan actividad de caspasa deficiente. La utilización de Bit 1 como diana terapéutica requiere un examen detallado del mecanismo de su función de la apoptosis, lo que hemos encontrado que depende en parte de apagar un programa de transcripción de genes promotora de la supervivencia controlada por el groucho transcripcional corepressor TLE1 [15].
El papel de Bit1 en anoikis ha sido demostrada en varias líneas celulares transformadas. A través de enfoques de manipulación genética, se ha demostrado que la expresión exógena de mitocondriales BIT1 bloques de la resistencia anoikis de varias líneas de células tumorales, mientras que la regulación por disminución de la expresión endógena Bit1 confunde aún más su anoikis insensibilidad [11] - [15]. Desde la adquisición de resistencia a la anoikis es un determinante importante de la transformación neoplásica y el potencial metastásico [1], [2], la supresión de la vía de anoikis Bit1 en las células malignas puede contribuir a la progresión del cáncer, en particular en la adquisición de comportamiento tumorigénico y metastásico avanzado. De hecho, nuestros estudios anteriores demostraron que Bit1 puede funcionar como un supresor de la metástasis
in vivo
[14]. Aunque el mecanismo exacto que subyace a su efecto inhibidor de la metástasis está aún por definir, el Bit 1 Anoikis función de la inducción puede desempeñar un paso limitante de la velocidad en el proceso de metástasis. Curiosamente, el papel de Bit 1 en la tumorigénesis no se ha demostrado hasta la fecha.
Para abordar el papel de Bit 1 en la formación del cáncer, hemos realizado preliminar de búsqueda de base de datos en línea para examinar si la expresión Bit 1 se altera en diversos tipos de tumores humanos, en comparación con sus homólogos normales. Curiosamente, se ha encontrado que la expresión Bit1 es selectivamente y significativamente suprimida en cáncer de pulmón. Este hallazgo preliminar, junto con la reciente evidencia que documenta que TLE1 puede funcionar como un oncogén específica de pulmón [16], nos ha llevado a investigar la importancia de la ruta apoptótica Bit 1 en la insensibilidad anoikis y el potencial tumorigénico de células no pequeñas de pulmón Carcinoma ( NSCLC), que es la forma más agresiva de cáncer de pulmón y es altamente quimiorresistente en parte debido a una deficiente vía de la apoptosis dependiente de caspasa [17], [18]. Aquí, mostramos que el Bit 1 exógeno evita la anoikis resistencia de las células de adenocarcinoma de pulmón A549 humano a través de la activación de la apoptosis independiente de caspasas e impide su crecimiento independiente de anclaje. Consistentemente, desmontables de Bit 1 endógena en estas células mejora aún más sus anoikis insensibilidad y anclaje independiente potencial de
in vitro
y potencia su crecimiento tumorigénico
in vivo
. En línea con su función supresora de tumores, se encontró que la expresión Bit1 ser regulados a la baja en los tumores de NSCLC.
Materiales y Métodos Los ensayos
Cultivo de células y transfección celular
NSCLC A549 y H460 líneas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glutamina que contiene 10% de suero bovino fetal, penicilina, y estreptomicina. El control derivado A549 estable y piscina Bit1 shRNA de las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glutamina que contenía suero bovino fetal 10%, penicilina, estreptomicina, y 1 mg /ml de puromicina (Invitrogen). Ensayos de transfección transitoria se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para células A549 y reactivo Lipofectamine LTX (Invitrogen) para células H460 en OPTI-MEM (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante con la cantidad total de plásmido utilizado por transfección normalizada con el correspondiente construcción de vector vacío.
reactivos químicos, anticuerpos y plásmidos
el poli (metacrilato de 2-hidroxietilo (poliHEMA) y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-FLAG, anti-AES, anti-GFP y anti anticuerpos -B-actina fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). el anticuerpo anti-TLE1 policlonal fue obtenido de Abcam (Cambridge, MA). el inhibidor de caspasa zVAD-fmk y el anticuerpo anti-myc se adquirieron de Calbiochem ( La Jolla, CA). El anti-caspasa-3, anti-exfoliados caspasa-3, Bcl-2, Bcl-XL, anticuerpos Bax, Bad y anti-PARP se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). La mamífero que codifica vector de expresión para Bit1 mitocondrial se generaron como se describe anteriormente [11]. Los plásmidos GFP-TLE1 se obtuvieron de Origene (Rockville, MD). El constructo que codifica el dominio de muerte celular (CDD) de Bit1 se obtuvo del Dr. Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) y se caracterizó anteriormente [19].
siRNA y shRNA transfección
los siRNAs específicos TLE1 y el control siRNAs dirigidos no se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Para los experimentos de transfección transitoria, las células A549 (2 × 10
5) fueron transfectadas con 25 mM de cada siRNA usando el reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). 48 horas después de la transfección, las células se recogieron y se sometieron a ensayos de inmunotransferencia o anoikis como se describe a continuación. Para generar A549 estable BIT1 desmontables y control de piscinas, células de los padres A549 se transfectaron con el vector que contiene el pRS corta horquilla de ARN contra TLE1 (Origene) o el shRNA orientación no revueltos (Origene). 48 h después de la transfección, 1 mg /ml de puromicina (Invitrogen) se añadió al medio para seleccionar clones resistentes a la puromicina. Los clones individuales resistentes a la puromicina fueron seleccionados para Bit1 regulación a la baja por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo específico para Bit11 [15]. Dos Bit 1 shRNA desmontables clones positivos y dos clones shRNA de control se combinaron para una caracterización adicional.
Análisis de la apoptosis, la anoikis, y la viabilidad celular
La apoptosis se determinó cuantificando el nivel de fragmentos citosólicos nucleosomal con el uso de la célula kit ELISA de detección de muerte (Roche Molecular Biochemicals) según las instrucciones del fabricante [14], [15]. Para evaluar para la muerte celular anoikis, se sembraron células sobre poliHEMA recubrieron placas de 96 pocillos en medio de crecimiento completo que contiene 0,5% de metilcelulosa a una densidad de 1,0 × 10
4 /pocillo a diversos puntos de tiempo como se describe anteriormente [14], [15 ]. a continuación, se recogieron las células desprendidas y se someten al ensayo de apoptosis la muerte celular ELISA. La viabilidad celular se cuantificó mediante tinción con azul de alarmar (Invitrogen) y la posterior lectura de fluorescencia (longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda 520 nm de emisión) usando el lector de microplacas (BioTek Instruments).
proliferación celular y ensayos de agar suaves
crecimiento dependiente de anclaje se determinó mediante siembra de las células en un volumen de 150 ml a una densidad de 2.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. En cada tiempo indicado, se midió el número de células metabólicamente activas con el uso de ensayo de MTT como se describe anteriormente [15]. Brevemente, se añadieron diez microlitros de reactivo MTT a 5 mg /ml (Sigma) a cada pocillo en una placa de 96 pocillos. La placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 h. Después, el precipitado MTT resultante se disolvió en 100 ul de una MeOH-50% de solución DMSO 50% y se somete a una lectura de la absorbancia 550 nm mediante un lector de microplacas (BioTek Instruments). El crecimiento independiente de anclaje de células se valoró utilizando el formato de placa de 96 pocillos [15]. Como se describió previamente, de 5.000 células en solución de agar 0,3% se sembraron en pocillos recubiertos previamente con agar 0,6% en medio de cultivo. El crecimiento de las colonias resultantes se cuantificó por tinción con azul de alarmar (Invitrogen) y lectura de fluorescencia a 485 nm de longitud de onda de excitación y 520 nm de longitud de onda de emisión con un lector de placas de microplacas.
caspasa ensayo de activación de
caspasa -3 se determinó la actividad fluorométricamente utilizando el sustrato sustrato Ac-DEVD-AFC y se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science).
preparación de proteínas y ensayos de transferencia de Western
preparación de proteínas y occidental blotting se realizó como se describió anteriormente [14], [15]. Brevemente, las células se recogieron 24 a 48 h después de transfección con diversas construcciones o siRNAs mediante la adición de tampón de lisis enfriado en hielo NP-40 (1% NP-40; 20 mM Tris-HCL [pH 7,4]; NaCl 150 mM; 10% de glicerol , vanadato de 2 mM de sodio; 1 mM de fluoruro de henylmethylsulfonyl; 10 mg /ml leupeptina, y 5 mg /ml de aprotinina) y se incubaron a 4 ° C durante 20 min. Para el análisis de inmunotransferencia, cantidades iguales de proteínas se resolvieron en 4-20% de geles de Tris-glicina de gradiente (Invitrogen) y se transfirió electroforéticamente a membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. Las membranas fueron desarrolladas utilizando el sistema de detección ECL.
Fraccionamiento subcelular
Fraccionamiento subcelular se llevó a cabo como se describe anteriormente [15]. células Brevemente, transfectadas cultivadas en condiciones asociadas o separados en los tiempos indicados se cosecharon lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en 1 ml de tampón mitocondrial isotónica (manitol 250 mM, sacarosa 70 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM [pH 7,5]) y se homogeneizaron con 40 golpes en un homogeneizador Dounce. Los lisados se centrifugaron a 500 x g durante 5 min para eliminar los núcleos y las células intactas. El sobrenadante se centrifuga a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C para aislar el sedimento enriquecido mitocondrial. El sobrenadante citosólico resultante se sometió a electroforesis en SDS-PAGE e inmunotransferencia. Para la separación del citosol y la fracción nuclear, el kit de aislamiento nuclear NE-PER (Pierce, Nº 78833) se utilizó y realizado según lo prescrito por el fabricante [15]. La concentración de proteínas en las diferentes fracciones se cuantificó usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad con BSA como patrón.
Coimmunoprecitation ensayo
ensayo
coimmunoprecipitation se realizó como se describe anteriormente [15]. Brevemente, las células transfectadas se cosecharon por lavado una vez con PBS y se resuspendieron en helado de Nonidet P-40 tampón de lisis (1% Nonidet P-40, 20 mm de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 10% de glicerol, 2 mm vanadato de sodio, 1 mm fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg /ml de leupeptina, y 5 mg /ml de aprotinina), seguido de una incubación de 20 min a 4 ° C. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. etiquetada Myc-Bit 1 se inmunoprecipitó con conjugado anti-myc-agarosa (Abcam), mientras que GFP-etiquetados TLE1 se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-GFP-agarosa (Médica y Biológica Laboratories). El inmunoprecipitado se lavó a fondo con tampón de lisis. Las proteínas unidas se resolvieron mediante SDS-PAGE y Western Blot se realizó con el anticuerpo correspondiente.
En vivo
tumorigénesis ensayo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de uso y Cuidado de Animales de laboratorio de la Universidad Xavier de Louisiana Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, número de aprobación 060911-001BI). Ocho semanas de edad ratones hembra desnudos atímicos (BALB /c) se utilizaron para los ensayos de la tumorigénesis. Las células de control A549 derivada shRNA y Bit 1 shRNA (1,0 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea. Los tamaños tumorales se midieron periódicamente con una pinza, y el volumen del tumor se determinó con la fórmula (d1 × d2
2) /2, donde d1 representa el diámetro mayor y D2 del diámetro más pequeño. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores primarios alcanzaron 2 cm de diámetro.
In Situ de detección de apoptosis
La detección de células apoptóticas en el control de shRNA y las secciones del tumor BIT1 shRNA se ha realizado mediante el sistema colorimétrico TUNEL DeadEnd ( Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron con proteinasa K durante 20 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con una concentración de trabajo de recombinante Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa (IDTE) a 37 ° C durante 1 h. Las secciones fueron el lavaron con PBS y se sumergieron en peróxido de hidrógeno 0,3% para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Las secciones se lavaron a continuación con PBS y se incubaron con la solución de estreptavidina-HRP. La señal de color marrón oscuro resultante se visualizó con diaminobencidina (DAB) como cromógeno.
tumor de pulmón humano gama análisis del tejido
tumorales humanas diapositivas de matriz de tejido que contienen los carcinomas de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes, y tejidos pulmonares normales emparejados se obtuvieron de EE.UU. Biomax, Inc. (Rockville, MD). El procedimiento se realizó inmunohistoquímica por Biomax Inc. en dos diapositivas de microarrays de tejidos. Como se ha descrito anteriormente [14], [15], las diapositivas de la matriz de tejido se deparaffinised, hidratado y se somete a recuperación de antígeno. Los portaobjetos se incubaron a continuación en suero normal de caballo 2,5% durante 30 min a temperatura ambiente seguido por incubación con el anticuerpo primario (dilución 1:100) durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo de conejo purificado por afinidad anti-Bit1 (HPA012897) que fue probado previamente para su especificidad [14], [15] se adquirió de Sigma. suero normal de conejo se utilizó como anticuerpo de control negativo para sustituir el anticuerpo primario en la diapositiva de control con 1 h de incubación. a continuación, las diapositivas de la matriz de tejido se lavaron y se incubaron con reactivo de ImmPRESS (Vector Laboratories), seguido de tratamiento con solución de sustrato de peroxidasa DAB (DAKO Cytomation). Las diapositivas se anotó para la tinción de intensidad media Bit 1 por dos investigadores sin ningún conocimiento de la condición patológica de las muestras. La tinción media se calificó como 0, no tinción; 1, ligeras manchas; 2, tinción moderada; y 3, fuerte tinción.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como medias (± S.E.). Para manchas y los ensayos de anoikis occidental, los experimentos se realizaron al menos tres veces con triplicados. Se encontraron diferencias estadísticas entre los grupos en un valor de P & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student de dos colas. Para el análisis de matriz de tejido tumoral de pulmón, un ANOVA de una vía con posterior ensayo post hoc mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer se utilizó para comparar la intensidad media de tinción de cada tipo de casos [14], [15]. Todos los cálculos se realizaron utilizando el software estadístico NCSS (NCSS, Kasville, UT)
Resultados
El anoikis resistencia de las células A549 se asocia con la falta de actividad de caspasa significativo
NSCLC células son conocidos notoriamente a ser resistentes a las diversas formas de estímulos apoptóticos, incluyendo la estimulación del receptor de muerte, fármacos citotóxicos, y la radiación. La capacidad de NSCLC para evadir la apoptosis se ha atribuido en parte a un mecanismo independiente de caspasas ineficiente [17], [18]. Sin embargo, los mecanismos de cómo NSCLC bloques anoikis no han sido examinados a fondo. Para hacer frente a la utilidad potencial de los mecanismos de caspasa-independiente de eludir la anoikis resistencia de las células NSCLC, lo primero que examinó la contribución de la vía caspasa en anoikis. De acuerdo con informes anteriores [20], la línea celular A549 NSCLC mostró muy bajo nivel de apoptosis cuando se cultivan en suspensión (Figura 1A). Estaurosporina (STS), un inhibidor de quinasa potente, indujo significativamente la apoptosis en estas células (Figura 1A). Para abordar el papel de la ruta dependiente de caspasa en el bloqueo anoikis en las células A549, se analizó la liberación citosólica de la proteína citocromo c mitocondrial (un factor crucial en la activación de las caspasas efectoras aguas abajo) durante el desprendimiento. En contraste con las células tratadas STS que mostraban cantidades sustanciales de citocromo c en el citoplasma, las células desprendidas exhibieron sólo pequeñas cantidades de citocromo c en la fracción citoplásmica (Figura 1B). A continuación, monitorizamos la activación de la caspasa corriente abajo o ejecutor 3 a través de la escisión de la caspasa-3 sustrato fluorescente (Figura 1C) y el procesamiento de pro-caspasa 3 a través de inmunotransferencia (Figura 1D). En línea con la falta de liberación citosólica significativa de citocromo c, las células A549 unifamiliares no mostraron sustancial activación de caspasa 3 (Figura 1C) y se muestran sin procesamiento de pro-caspasa 3 (Figura 1D). El objetivo final de la maquinaria de la caspasa es para escindir el poli nuclear (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), la proteína [5], [6]. Como se muestra en la Fig. 1E, PARP se mantuvo relativamente intacto en su forma nativa de 116 kDa en las células A549 separados (Figura 1E). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que la resistencia anoikis de las células A549 se asocia con una vía ineficiente de citocromo c /caspasa dependiente de la muerte celular.
A. Las células se cultivaron estar unido (A) o separado de la ECM durante 24 horas (D24) y 48 horas (D48) y se recogieron para el análisis de apoptosis usando el Cell Death Elisa ELISA. En paralelo, las células también se trataron con 1 M de estaurosporina (STS) durante 24 horas y se sometieron a la muerte celular Elisa ELISA. fracciones B. citosólicos se obtuvieron a partir de células en A y se analizaron para la presencia de citocromo c por Western blot. C. La presencia de la actividad de caspasa-3-como en los lisados celulares de las células tratadas en A se determinó mediante la escisión de un sustrato fluorescente z-DEVD-AFC (DEVD). D. y E. Las células en A se sometieron a transferencia de Western para detectar el procesamiento de pro-caspasa 3 (D) y PARP (E). En A y C, tres experimentos independientes se realizaron por triplicado, * indica p. & Lt; 0,05 en comparación con condiciones adjuntas (prueba t de Student) guía empresas
BIT1 deteriora la resistencia Anoikis de las células de carcinoma de pulmón
Considerando la falta de significativa activación de caspasa inducida por el desprendimiento en las células A549, que entonces explorado el papel de la vía de la muerte celular Bit1 en la supervivencia independiente del anclaje de estas células. Hemos aumentado la expresión de Bit 1 mitocondrial en las células A549 mediante transfección con un constructo Bit 1 que expresa la proteína Bit 1 exclusivamente en la mitocondria (Bit 1 Mito) [11], [15], y puesto a prueba la capacidad de las células para sobrevivir en ausencia de apego desde el ECM. El mito Bit1 y control de las células transfectadas tenían el mismo nivel de apoptosis espontánea cuando se cultiva unido a una placa de cultivo (Figura 2A). En contraste, las células transfectadas de Mito BIT1 exhibidos aumentaron significativamente la apoptosis de las células de control sobre la separación. Se encontraron resultados similares cuando Bit1 mito se introdujo en la línea humana de células NSCLC H460 (Figura S1). Para abordar la especificidad de la inducción anoikis por Bit1 Mito, nos centramos en la expresión Bit1 en el citoplasma de las células A549 con el uso de una construcción Bit1 que contiene una etiqueta en la región N-terminal de la proteína Bit1 (Bit1 cito) [11] , [15]. la expresión exógena de Bit 1 citoplasmática localizada (Bit 1 cito) en el A549 (Figura 2B) y células H460 (Figura S2) desencadena la apoptosis. El dominio de muerte celular (CDD) de Bit1 fue mapeado recientemente en el N-terminal de 62 aminoácidos y se demostró que era eficaz en la inducción de apoptosis en células de cáncer de mama [19]. Introducción del péptido CDD también dio lugar a la apoptosis en células A549 (Figura 2C) y células H460 (Figura S3). Además de la caracterización de la anoikis vía Bit1 en células A549 confirmó que Bit1 desencadena la muerte celular independiente de caspasas. En primer lugar, no encontramos un procesamiento significativo de la caspasa 3 en células verdugo Bit 1 transfectadas (Figura 2D). En segundo lugar, el sustrato nuclear aguas abajo de las caspasas, PARP, se mantuvo intacta (Figura 2D). En tercer lugar, el inhibidor pan-caspasa z-VAD-FMK no fue eficaz en el bloqueo de la anoikis inducidas por Bit 1 (Figura 2E). De acuerdo con la falta de efecto Bit1 en la activación de caspasas, la expresión de la familia de los reguladores de la apoptosis que controlan la vía apoptótica mitocondrial dependiente de caspasa no se alteró por Bit1 (Figura 2D). En particular, los niveles de estado estacionario de los anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL proteínas, así como la pro-apoptótica Bax y Bad proteínas se mantuvo sin cambios por ectópico Bit 1 en ambas condiciones de montar y desmontar. Estos hallazgos indican que Bit1 puede eludir la resistencia anoikis de células de cáncer de pulmón a través de la inducción de una ruta apoptótica independiente de caspasas.
A. Las células fueron transfectadas con el mitocondrial C-terminal con etiqueta myc localizada Bit1 (Bit1 mito) o el constructo de vector vacío. 24 h después de la transfección, las células fueron cultivadas ser conectado o desconectado desde el ECM. Después de 48 h en cultivo, se recogieron las células y se analizaron para la apoptosis mediante la medición de la cantidad de fragmentos de ADN de las histonas (Cell Death ELISA). B y C. Las células fueron transfectadas con el N-terminal myc etiquetado citoplásmico localizada Bit1 (Bit1 cito) (B), Bit1 dominio de muerte celular (CDD) (C), o construcción de vector y 48 h después, las células fueron sometidas a la muerte celular ELISA. D. vector o BIT1 Mito células transfectadas se cultivaron estar unido (A) o individual (D) de la ECM durante los tiempos indicados. Las células se recogieron a continuación y se sometieron a transferencia de Western contra anticuerpos específicos para la caspasa-3, PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, myc, y B-actina. Mito células transfectadas E. BIT1 se cultivaron en condiciones conectados o desconectados en presencia de z-VAD-FMK (50 uM) o DMSO durante 48 h. Las células fueron cosechadas y sometidas a la muerte celular ELISA. En A, B, y C, tres experimentos independientes se realizaron por triplicado, * indica p. & Lt; 0,05 mediante la prueba t de Student
Para confirmar aún más el papel de Bit 1 como un efector anoikis en el cáncer de pulmón, examinamos si la caída de la expresión endógena Bit 1 tendrá un impacto en la anoikis falta de sensibilidad de las células A549. Pensamos que las células A549 se someterán a la anoikis sobre la cultura prolongada en suspensión y si la ablación de la vía apoptótica Bit 1 puede proporcionar protección anoikis. De hecho, después de una prolongada cultivo de 72 hr en suspensión, las células A549 separadas finalmente mostraron evidencia de apoptosis (Figura 3A). La inducción anoikis observado se asoció con ningún procesamiento significativo de la caspasa 3 y PARP (Figura 3B), lo que indica que el mecanismo (s) la muerte celular alternativa distinta de la vía dependiente de caspasa está involucrado. A continuación, regulados a la baja expresión Bit 1 en las células A549 a través de los ARN-corto de interferencia (siRNAs) y se sometieron las células tratadas siRNA BIT1 y control a ensayo anoikis. Dos siRNAs específicos BIT1#1 y#2 mostraron una significativa 70-80% regulación a la baja de la expresión Bit 1 (Figura 3C). En comparación con las células tratadas con siRNA de los padres o de control A549, las células Bit1 siRNA transfectadas mostraron una disminución de la apoptosis después de un cultivo de 72 h en suspensión (Figura 3D). Para complementar estos resultados, también generamos dos clones estables Bit 1 desmontables A549 derivados, a saber Bit 1 Bit 1 shRNA1 y shRNA2, con cada clon que expresa una clara Bit 1 shRNA que se dirige a una secuencia diferente de región no codificante 3 'del ARNm Bit 1. En paralelo, un control estable shRNA clones 1 y 2 se generaron a partir de la nontargeting revueltos shRNAs. Como se muestra en la Figura 3E, el establo Bit1 shRNA1 y shRNA2 mostraron una reducción en la expresión Bit1 por 70% y 80% respectivamente, en comparación con el control de clones ARNhc. El establo Bit 1 shRNA1 y shRNA2 se combinaron para generar la piscina Bit 1 shRNA de control, mientras que los clones shRNA 1 y 2 comprenden el control shRNA piscina (Figura 3E). En consonancia con los datos derivados de los estudios de siRNA, la piscina Bit 1 shRNA muestran un nivel significativamente más reducida de la apoptosis que el control shRNA piscina después de un cultivo de 72 h en suspensión (Figura 3F). De acuerdo con la falta de efecto de ectópico Bit1 en la ruta mitocondrial (Figura 2D), la mayor resistencia anoikis observado en desmontables células BIT1 no se asoció con cambios en los niveles de expresión de la familia Bcl-2 de reguladores de la apoptosis (Figura S4). Estos hallazgos, junto con nuestros resultados indican que exógena Bit1 mitocondrial puede inducir anoikis, proporcionan una fuerte evidencia de que la ruta apoptótica Bit 1 representa un importante mecanismo de anoikis independiente de caspasas en células de cáncer de pulmón.
a. y B. Las células fueron cultivadas en adjunto (A) o condiciones unifamiliares (D) durante los tiempos indicados y después se sometieron a sometido a la muerte celular ELISA (A) o el Western Blot (B) con anticuerpos contra la caspasa-3, PARP, y B -actina. En A, tres experimentos independientes se realizaron por triplicado; *, P & lt; 0,05 en comparación con las células unidas (prueba t de Student). C. y D. Las células fueron transfectadas con siRNAs específicos o de control BIT1, y 48 h después, las células se sometieron a inmunotransferencia (C) con anticuerpos contra Bit1 y B-actina para confirmar la caída de expresión Bit1. Allen et al.